Purmorphamine对BV2细胞帕金森病相关基因Nurr1表达的影响

洪乐鹏　邵帅　汪光亮

511436 广州医科大学人体解剖教研室



Purmorphamine对BV2细胞帕金森病相关基因Nurr1表达的影响

洪乐鹏邵帅汪光亮

511436 广州医科大学人体解剖教研室

摘要：目的探讨Purmorphamine(PM)激活小胶质细胞瘤BV2细胞中Sonic hedgehog(SHH)信号通路对帕金森病(PD)相关基因Nurr1表达的影响。 方法体外培养BV2小胶质细胞并分为对照组、脂多糖(LPS)处理组、PM+LPS处理组以及PM处理组，运用荧光定量PCR(Q-PCR)检测经LPS处理后BV2细胞中SHH信号通路Smoothened(Smo)、Gli1 及Nurr1 基因mRNA 表达情况；PM激活SHH信号通路后，Q-PCR检测Nurr1 mRNA含量以及炎性反应因子白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的mRNA表达情况。结果(1)与对照组相比，LPS处理后4 h和24 h时Smo和Gli1 mRNA表达均升高(P<0.01，P<0.05)；(2)与对照组相比，PM处理组细胞Smo和Gli1 mRNA表达升高(P<0.01)，LPS组Nurr1、IL-1β、TNF-α mRNA表达亦均升高(均P<0.01)；而PM+LPS组Nurr1、IL-1β、TNF-α mRNA表达均较LPS处理组下降(均P<0.01)。结论PM激活SHH信号通路能够抑制BV2细胞中Nurr1的表达，并能发挥抑制炎性反应作用。

关键词：Purmorphamine；BV2细胞；帕金森病；Nurr1；炎症

帕金森病(Parkinson disease，PD)多发生于中老年人，是第二大中枢神经系统退行性疾病，主要病理改变为中脑黑质致密部多巴胺能神经元丢失、死亡，导致黑质纹状体内多巴胺(DA)含量下降，残存神经元内形成以α-突触核蛋白为主要成分的路易小体，其症状主要表现为静止性震颤、肌僵直、运动迟缓、姿势平衡障碍，可伴有焦虑、抑郁、睡眠障碍等非运动症状[1]。其发病机制至今尚未明确，越来越多的证据显示小胶质细胞的激活及其参与的神经炎性反应在PD的发病中扮演重要角色[2]，激活的小胶质细胞可加速诱导型一氧化氮合酶(iNOS)以及促炎因子如白细胞介素-1β(IL-1β)、IL-6、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的表达[3-5]，这些均与PD患者和PD模型黑质区多巴胺能神经元的退变有关。孤核受体家族成员Nurr1 基因不仅在维持多巴胺能神经元的发育和分化中起重要作用，而且在抑制小胶质细胞炎性反应基因表达以及在炎性反应中保护多巴胺能神经元发挥重要的作用[4]。

作为神经系统发育的重要信号通路——Sonic hedgehog(SHH)信号通路对多巴胺能神经元的发育、分化具有关键的调控作用[6]。体外研究表明SHH对氧化应激损伤的神经元具有保护作用[7]。Purmorphamine(PM)作为SHH信号通路的激活剂，能够与SHH通路中的Smo结合调控SHH信号通路的激活，但目前关于PM激活SHH通路对Nurr1基因表达的影响报道较少。

1材料和方法

1.1材料BV2细胞株由南方医科大学人体解剖教研室惠赠。DMEM高糖培养基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶(含EDTA)、青霉素、链霉素购自美国GIBCO公司，脂多糖(LPS，E.coli serotypeO55：B5)购自美国Sigma公司，PM购自美国Santa Cruz公司，Trizol 购自美国Invitrogen 公司。RT-PCR反转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒、RNase-free H2O购自TakaRa公司。

1.2方法

1.2.1BV2细胞培养：将小胶质细胞瘤BV2细胞培养于DMEM(高糖)+10%胎牛血清+100 U/mL双抗，置于37℃、含5% CO2空气的培养箱中培养，每天换液，待细胞贴壁生长至融合度达70%～80%左右，用胰酶消化，按1∶3传代。

1.2.2细胞处理及分组：细胞贴壁生长状态良好后消化细胞，以1×105/ mL接种于6孔板培养，每孔加入2 mL完全培养基，培养箱中培养。第2 天换液后将细胞分为4组：LPS处理组给予1 μg/mL LPS孵育，并于4 h和24 h提取RNA；PM处理组给予1.5 μmol/L PM孵育24 h后提取RNA；PM+LPS共孵育组给予1.5 μmol/L PM孵育24 h，然后加入1 μg/mL LPS继续孵育24 h，提取RNA；对照组给予等量生理盐水。

1.2.3实时荧光定量PCR检测：采用实时荧光定量PCR检测Smo、Gli1、IL-1β、TNF-α、Nurr1 mRNA表达水平。Trizol法提取各组细胞总RNA，采用RT-PCR 反转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA，以cDNA 为模板，添加表1中相关引物(Invitrogen 公司合成)扩增各基因。用Nano-Drop-1000分光光度计、ABI 7500软件检测Smo、Gli1、IL-1β、TNF-α、Nurr1 mRNA表达水平。荧光定量PCR扩增条件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，共40个循环；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，扩增完毕后分析扩增曲线和溶解曲线。每组实验均重复3次。

表1　RT-PCR检测引物

注：IL-1β：白细胞介素-1β；TNF-α：肿瘤坏死因子-α

1.3统计学处理采用SPSS13.0软件进行统计学分析，数据以均数±标准差表示，数据经正态性和方差齐性检验，两均数间比较采用独立样本t检验，多组均数间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t法。以P<0.05 为差异具有统计学意义。

2结果

2.1LPS对BV2 细胞SHH信号通路的影响LPS作用BV2细胞4、24 h时SHH通路相关基因Smo、Gli1 mRNA水平较生理对照组均明显上调(P<0.01，P<0.05)，表明在LPS作用下小胶质细胞中内源性SHH信号通路激活(表2)。

表2　LPS作用不同时间BV2 细胞中Smo和

注：LPS：脂多糖

2.2PM对BV2 细胞SHH信号通路的影响PM处理24 h后Smo、Gli1 mRNA水平均较对照组明显升高(P<0.01)，表明PM可激活SHH信号通路(表3)。

表3　PM作用24 h时BV2 细胞中Smo、Gli1 mRNA

注：PM：Purmorphamine

2.3PM 激活SHH信号通路对BV2细胞Nurr1基因表达的影响与对照组相比，LPS处理后Nurr1 mRNA 表达上调(P<0.01)；与LPS组相比，PM预处理后能够明显抑制LPS诱导的Nurr1 mRNA表达上调(P<0.01)，表明PM激活SHH信号通路后对Nurr1 mRNA表达有抑制作用(表4)。

表4　各组BV2细胞Nurr1、IL-1β、TNF-α mRNA

注：与对照组相比，aP<0.01；与LPS处理组相比，bP<0.01；与PM+LPS组相比，cP<0.05

2.4PM激活SHH信号通路对BV2细胞炎性反应因子表达的影响与对照组相比，LPS处理后IL-1β、TNF-α mRNA明显增高(均P<0.01)；与LPS处理组相比，PM处理后能够明显抑制LPS诱导的IL-1β、TNF-α mRNA表达上调(均P<0.01)；与PM+LPS组相比，PM单独处理后TNF-α mRNA明显下调(P<0.05)，IL-1β有下调趋势但差异无统计学意义(P>0.05)，表明PM激活SHH信号可发挥抑制炎性反应作用(表4)。

3讨论

PD是世界上第二大与年龄有关的神经退行性疾病，多发于中老年人，65岁以上老年人患病率为1%，85岁以上者患病率为5%[8]。目前PD的治疗方法主要针对伴随症状，而不能干预其进程，因此有关PD的发病机制及治疗研究显得更为重要。中枢神经系统的炎性反应会导致细胞死亡，并与PD的神经退变极为密切。本研究选用BV2细胞作为研究PD的炎性反应细胞模型，探讨了PM激活BV2细胞中SHH信号通路对PD相关基因Nurr1表达的影响。

SHH信号通路是与神经发育有关的重要通路，在神经损伤的修复过程中也起着一定的作用。有研究发现在PD模型中脑黑质区存在SHH信号通路激活，可能与多巴胺能神经元的损伤修复有关[9]。本研究结果显示，在LPS作用下BV2细胞Smo、Gli1 mRNA表达升高，提示在细胞炎性反应状态下导致了内源性SHH信号通路的激活，但其具体机制不明，间接表明SHH信号通路与神经炎性反应在PD的发病机制中存在着一定联系，共同影响疾病的发生。

综上所述，本研究发现PM激活SHH信号通路对小胶质细胞中的Nurr1基因有抑制作用，其中抑制炎性反应的具体机制尚不明确，有待进一步研究查证，这为从炎性反应方向研究PD提供了新的思考，为PD的临床治疗提供了理论基础。

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[8]Dai Y，Wu Y，Li Y.Genetic association of cyclooxygenase-2 gene polymorphisms with Parkinson′s disease susceptibility in Chinese Han population[J].Int J Clin Exp Pathol，2015，8(10)：13495-13499.

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(本文编辑：时秋宽)

Effect of purmorphamine on Parkinson′s disease-related Nurr1 gene expression in BV2 cells

HONGLepeng*，SHAOShuai，WANGGuangliang.

*DepartmentofAnatomy，GuangzhouMedicalUniversity，GuangzhouGuangdong511436，ChinaCorresponding author：HONG Lepeng，Email：honglepeng@163.com

ABSTRACT：ObjectiveTo investigate the effect of Sonic hedgehog(SHH)signaling pathway activated by purmorphamine(PM)on the expression of Parkinson-related gene Nurr1 in BV2 microglial cells.Methods The routinely cultured BV2 microglial cells in vitro were divided into the control group，the lipopolysaccharide(LPS)group，the PM + LPS group and the PM group.Real time quantitative PCR was used to detect contents of SHH relevant gene Smoothened(Smo)，Gli1 and Nurr1 mRNA in BV2 cell after LPS stimulation.The contents of Nurr1 and the expression of inflammatory factor -1β(IL-1β)，tumor necrosis factor-α(TNF-α)mRNA were detected by real time quantitative PCR after SHH signaling pathway activation by PM. Results(1)Compared with the control group，the expression levels of Smo and Gli1 significantly increased 4 hours and 24 hours after LPS stimulation (P<0.01，P<0.05).(2)Compared with the control group，the expression levels of Smo and Gli1 significantly increased after PM treatment(P<0.01，respectively).The expression levels of Nurr1 and IL-1β，TNF-α also significantly increased in the LPS group(P<0.01，respectively).Compared with the LPS group，the expression levels of Nurr1，IL-1β and TNF-α decreased in the PM + LPS group(P<0.01，respectively). ConclusionsSHH signaling pathways activated by PM can inhibit the expression of Nurr1 in BV2 cells，and play a role in inhibiting inflammation.

Key words：purmorphamine；BV2 cell；Parkinson′s disease；Nurr1；inflammation

doi：10.3969/j.issn.1006-2963.2016.03.009

基金项目：广东省科学技术厅资助项目(201301)；广东省医学科研基金厅资助项目(A2013239)

通讯作者：洪乐鹏，Email：honglepeng@163.com

中图分类号：R741.05

文献标识码：A

文章编号：1006-2963(2016)03-0195-04

(收稿日期：2015-12-01)