抗Gly m Bd 28K单克隆抗体的制备及其免疫学特性

闫慧丽，席　俊，高学梅，贺梦雪，陈　哲，陆启玉

(河南工业大学 粮油食品学院，河南 郑州 450001)

抗Gly m Bd 28K单克隆抗体的制备及其免疫学特性

闫慧丽，席俊*，高学梅，贺梦雪，陈哲，陆启玉

(河南工业大学 粮油食品学院，河南 郑州 450001)

摘要：利用Gly m Bd 28K天然蛋白免疫BALB/c雌性小鼠，取小鼠脾脏细胞与杂交瘤细胞融合，筛选出2株能稳定分泌抗Gly m Bd 28K单克隆抗体的杂交瘤细胞株1E3和2F4。体内诱生腹水法大量制备单克隆抗体，经纯化后，得到2株均为IgG1型的单克隆抗体mAb1E3和mAb2F4。间接ELISA方法测得mAb1E3的效价达到1∶4.10×105，对Gly m Bd 28K蛋白的半数抑制率(IC50)为23.99 μg·L-1，与花生蛋白、核桃蛋白等的交叉反应率均低于0.1%。该单克隆抗体的制备为Gly m Bd 28K致敏蛋白的检测以及抗原表位的鉴定奠定了基础。

关键词：Gly m Bd 28K；杂交瘤细胞；单克隆抗体；间接ELISA

大豆是优质植物蛋白的来源，大豆及大豆制品多达30余种，以其丰富的营养深受消费者喜爱。然而，大豆中过敏原的存在限制了一部分人对大豆及其制品的摄取。引起大豆过敏的过敏原主要有Gly m Bd 30K，Gly m Bd 28K，Gly m 60K，此外，还有一些致敏原，如大豆疏水蛋白Gly m 1、大豆外壳蛋白Gly m 2、大豆抑制蛋白Gly m 3等[1]。

Gly m Bd 28K是大豆球蛋白7S组分中的一种，能够被大约25%的大豆过敏患者血清识别[2-3]。Kumari等[4]在黑豆中也分离、纯化出了Gly m Bd 28K，这表明Gly m Bd 28K很可能存在于多种豆科植物中。如果能够了解28K蛋白的致敏机制，降低28K蛋白的致敏性，将使很多对Gly m Bd 28K蛋白过敏的患者受益。本研究拟采用杂交瘤技术制备抗Gly m Bd 28K单克隆抗体，为Gly m Bd 28K过敏原的快速检测以及致敏机理的研究奠定基础。

1材料与方法

1.1材料

Gly m Bd 28K天然蛋白：由本实验室分离纯化，经SDS-PAGE鉴定纯度，具体方法参照席俊等[5]的论文；弗氏完全佐剂FCA，弗氏不完全佐剂FIA，聚乙二醇(PEG4000)，基础培养基RPMI-1640，选择培养基HAT、HT，均为Gibco产品；羊抗小鼠酶标二抗、TMB单组分显色液，均为Solarbio产品；胎牛血清，Sigma产品；单克隆抗体同种亚型试剂盒，Pierce产品；其他试剂市售所得，均为AR级。

7周龄SPF级BALB/c雌性小鼠4只，购自郑州大学医学院实验动物中心，在河南工业大学粮油食品学院实验动物房饲养；实验所用SP2/0骨髓瘤细胞由河南省农业科学院动物免疫学重点实验室提供。

1.2方法

1.2.1动物免疫

小鼠免疫前7 d，耳缘采血，制备阴性血清，于-20 ℃保存备用。7 d后，对小鼠进行背部皮下多点注射抗原，具体参照史巧巧等[6]的方法，首次免疫剂量为40 μg·只-1。4周后加强免疫，免疫剂量为第1次免疫的30%，每间隔3周加强免疫1次，共3次。试验小鼠10 d后断尾采血，离心(5 000 r·min-1，8 min)，收集上清置于-20 ℃备用。

1.2.2抗体血清效价的测定

采用间接ELISA方法[6]测抗体血清效价。(1)将Gly m Bd 28K天然蛋白用碳酸盐缓冲液(CBS)稀释至1 μg·mL-1后包板，50 μL·孔-1，4 ℃过夜，取出后用PBST充分洗涤，拍干；(2) 将200 μL含5%脱脂乳的封闭液加入酶标板， 37 ℃温育1 h，充分洗涤，拍干；(3)将1.2.1节中的抗体血清从1∶100倍开始，倍比稀释，加入到酶标板，50 μL·孔-1，分别以小鼠阴性血清和PBS做阴性和空白对照，37 ℃恒温箱中孵育15 min，完成后PBST充分洗涤，拍干；(4)取辣根过氧化酶标记的羊抗小鼠酶标二抗，1∶1 000倍稀释后加入到酶标板，50 μL·孔-1，37 ℃温育30 min，充分洗涤，拍干；(5)加入50 μL TMB单组分显色液，室温避光条件显色10～15 min后加入等量终止液；(6)在酶标仪上读取D450值，当P/N≥2.1时，抗体的效价为其最大稀释倍数。

1.2.3抗体血清敏感性的测定

抗体血清敏感性测定采用间接ELISA方法，1.2.2节中第(3)步改为：将Gly m Bd 28K蛋白稀释成不同质量浓度(3.125～800 μg·L-1)作为抑制剂(50 μL·孔-1)，加入1.2.2节中测得的D450值在1.0附近的相应稀释倍数的抗体(50 μL·孔-1)，其余步骤同效价的测定。参照龚芳等[7]论文中方法绘制敏感性曲线，横坐标为Gly m Bd 28K浓度的对数值，纵坐标为吸光率(B/B0)(B0是Gly m Bd 28K标准品浓度为0时吸光值，B是Gly m Bd 28K标准品不同浓度条件下的吸光值)。依据曲线推导回归方程，计算多抗血清对Gly m Bd 28K的IC50。

1.2.4杂交瘤细胞株的建立

取免疫效果较好的1只小鼠加强免疫：将40 μg Gly m Bd 28K天然蛋白溶解在200 μL无菌PBS中，注射到小鼠体内。96 h后，取小鼠脾脏细胞与SP2/0以大约1∶10的比例在PEG的作用下进行细胞融合，加入适量含有HAT的完全培养基，转移到96孔板上，置于37 ℃，5% CO2的培养箱中培养。10 d后，HAT培养基半量换液。12 d后，取细胞上清用间接ELISA测效价，以融合小鼠血清作阳性对照，以免疫前小鼠血清作阴性对照，筛选阳性孔。14 d后，改用HT培养基，将筛选出的阳性孔转移至24孔板扩大培养。待细胞长至1/2孔时，再次取上清测效价，对阳性孔进行3次有限稀释亚克隆。

1.2.5单克隆抗体的制备

单克隆抗体大量制备采用体内诱生腹水法：提前2周注射0.5 mL液体石蜡于BALB/c小鼠腹腔，然后将约1×106个的杂交瘤细胞注入到小鼠腹腔，待小鼠腹腔鼓起变硬后收集腹水，室温离心(3 000 r·min-1，5 min)，收集上清。

1.2.6单克隆抗体纯度和亚型的鉴定

将1.2.5节中上清液通过Protein G Sepharose亲和层析柱纯化，并以SDS-PAGE鉴定单克隆抗体的纯度[8-9]。根据单克隆抗体同种亚型试剂盒说明测定单克隆抗体的亚型。

1.2.7单克隆抗体效价和敏感性的测定

单克隆抗体的效价和敏感性测定参照1.2.2节和1.2.3节。

1.2.8单克隆抗体特异性的测定

选取花生蛋白、核桃蛋白、芝麻蛋白、小麦麦谷蛋白(河南工业大学蛋白质提取与制备实验室提供)作为竞争物，测定Gly m Bd 28K单克隆抗体对这些蛋白的IC50。交叉反应率(CR，%)=Gly m Bd 28K 单克隆抗体对 Gly m Bd 28K的IC50/各竞争物的IC50×100。

2 结果与分析

2.1抗体血清的效价和敏感性

间接ELISA法测得4只小鼠抗体血清效价(图1)均达到了1∶3.20×103，适合于细胞融合，其中2号小鼠的抗体血清效价最高，达到1∶6.40×103。由图2可知：4只小鼠中，2号小鼠抗体血清的敏感性最好(图中数据为3次实验结果的平均值)，其IC50为75.86 μg·L-1。因此，选取2号小鼠作为融合小鼠。

图1　小鼠抗体血清的效价Fig.1　Titer curves of mice antisera

图2　抗体血清的敏感性曲线Fig.2　Sensitivity curves of antisera

2.2单克隆抗体纯度与亚型的鉴定

多次克隆筛选后，得到2株杂交瘤细胞株，分别命名为1E3，2F4，其单克隆抗体分别命名为mAb1E3和mAb2F4。mAb1E3和mAb2F4的电泳图谱(图3)表明，纯化后的抗体在还原条件下只有两条蛋白条带，并无其他杂蛋白。采用亚型试剂盒测定mAb1E3和mAb2F4的亚型，结果表明mAb1E3和mAb2F4都是IgG1型。进一步证明电泳图谱上的2条蛋白条带为IgG抗体的重链和轻链，表明纯化后的抗体纯度较高。

2.3单克隆抗体的效价

M： 标准蛋白； 1: mAb1E3(未纯化)； 2: mAb2F4(未纯化)； 3: mAb1E3(纯化)； 4: mAb2F4(纯化)。图3　SDS-PAGE鉴定单克隆抗体的纯度Fig.3　SDS-PAGE analysis of the purity of monoclonal antibodies

间接ELISA测得单克隆抗体细胞株1E3和2F4的细胞上清效价分别为1∶1.28×103和1∶6.40×102，其腹水的效价分别为1∶4.10×105和1∶2.05×105，结果见表1。

表1单克隆抗体效价测定

Table 1The titers of Gly m Bd 28K mAb

单克隆抗体细胞上清腹水mAb1E31∶1.28×1031∶4.10×105mAb2F41∶6.40×1021∶2.05×105

2.4单克隆抗体的敏感性

获得的2株单克隆抗体中，mAb1E3的敏感性较好，其敏感性曲线如图4(图中数据为3次实验结果的平均值)，线性回 归方程为y=-0.237x+0.828，由此可以得出mAb1E3对Gly m Bd 28K的IC50为23.99 μg·L-1。

图4　mAb1E3的敏感性曲线Fig.4　The sensitivity curve of mAb1E3

2.5单克隆抗体的特异性

单克隆抗体mAb1E3特异性测定结果见表2。由表2可知，mAb1E3与花生蛋白的交叉反应率为0.096%，与核桃蛋白、芝麻蛋白、小麦麦谷蛋白的交叉反应率均低于0.03%，具有良好的特异性。

表2mAb1E3与其他蛋白的交叉反应

Table 2The cross-reactivity of mAb1E3 with other proteins

蛋白质IC50/(μg·L-1)CR/%GlymBd28K蛋白23.99100.0花生蛋白2.5×1049.6×10-2芝麻蛋白>105<0.03核桃蛋白>105<0.03小麦麦谷蛋白>105<0.03

3讨论

制备抗体，首先要考虑的问题就是抗原。一个良好的抗原必须具备足够大的分子量，较强的外源性和特异性。目前的免疫试验中，常用的抗原有3类：一类来自纯化的天然蛋白；一类来自纯化的重组蛋白；还有一类是半抗原与载体蛋白的偶联物。本实验室之前利用重组Gly m Bd 28K蛋白免疫Balb/C小鼠，成功制备出抗Gly m Bd 28K重组蛋白的单克隆抗体细胞株3F5，其抗体效价为1∶1.64×106，对重组Gly m Bd 28K蛋白的IC50为3.49 μg·L-1。从结果来看，用重组Gly m Bd 28K蛋白制备出的单克隆抗体的效价和敏感性都高于天然Gly m Bd 28K蛋白制备出的单克隆抗体，这说明抗原的制备方法很可能对抗体的免疫学特性有影响。杜智欣等[10]分别利用提纯的黄瓜花叶病毒M株系(CMV-M)病毒粒子和体外原核表达的外壳蛋白免疫健康家兔，制备了CMV-M多克隆抗体。检测结果表明，两种CMV-M 多克隆抗血清效价是一致的，但在检测病汁液灵敏度方面，以病毒粒子为抗原的多克隆抗血清明显优于以原核表达蛋白为抗原的抗血清，并且前者在样品量倍比稀释后Western-blot免疫条带清晰，后者条带模糊甚至消失。因此，在制备单克隆或多克隆抗体时，也要考虑到抗原的制备方法可能会对抗体产生的影响，选取合适的抗原制备方法。

细胞融合技术是细胞工程的核心技术，广泛应用于医药、食品、农业等领域，为单克隆抗体的制备以及新物种的培育等提供了有力的技术支持。影响细胞融合成败的因素较多，本实验室曾因骨髓瘤细胞生长状态不好而造成细胞融合的失败。因此，要保证细胞融合成功，就需要选取处于对数生长期的、没有污染的瘤细胞。除了瘤细胞的生长状态，促融剂也是影响细胞融合的一个关键因素。本试验中选用的促融剂是PEG 4000，其促融率相对较高，且价格低廉。由于PEG具有毒性，会对细胞产生损伤，因此PEG的作用时间相当重要。本试验中，将预热至37 ℃的PEG在1 min内以一定速度轻柔地加至瘤细胞与脾细胞的混合体系，避免了对细胞的过度损伤，最终保证了细胞融合的成功，并且细胞的融合率达到了79%，有利于进一步筛选阳性克隆。

大豆过敏引发的食品安全问题不容忽视，研究大豆过敏原的结构、特性，降低大豆的致敏性是当前的研究热点。表位是蛋白质抗原性的基础[11]，要研究大豆致敏机制，就必须全面了解大豆过敏原的抗原表位。目前，已有学者[12]利用单克隆抗体鉴定出了Gly m Bd 30K的部分抗原表位。本试验成功筛选出了2株抗Gly m Bd 28K天然蛋白的单克隆抗体，其中mAb1E3的效价达到1∶4.10×105，对Gly m Bd 28K天然蛋白的半数抑制率为23.99 μg·L-1，且特异性较好，与花生蛋白、核桃蛋白、芝麻蛋白、小麦麦谷蛋白的交叉反应均低于0.1%。Gly m Bd 28K单克隆抗体的制备为Gly m Bd 28K建立了一种快速、灵敏的检测方法，同时也为进一步的抗原表位研究奠定了基础。

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(责任编辑张韵)

Preparation of monoclonal antibodies against Gly m Bd 28K and identification of their immunological properties

YAN Hui-li， XI Jun*， GAO Xue-mei， HE Meng-xue， CHEN Zhe， LU Qi-yu

(SchoolofFoodScienceandTechnology，HenanUniversityofTechnology，Zhengzhou450001，China)

Abstract:To establish hybridoma cell lines that secreted anti-Gly m Bd 28K monoclonal antibodies， Gly m Bd 28K protein was used to immunize BALB/c mouse， whose spleen was removed for cell fusion. Two hybridoma cell lines that stably secreted anti-Gly m Bd 28K monoclonal antibodies were screened and then were injected into BALB/c mice to prepare monoclonal antibodies. After purification of monoclonal antibody， two strains of cell lines were identified for IgG1， named as mAb1E3 and mAb2F4. Indirect ELISA was used to detect the immunological properties of mAb1E3. The titer of mAb1E3 was 1∶4.10×105， and the IC50of mAb1E3 to Gly m Bd 28K was 23.99 μg·L-1. The ratios of cross-reactivity of mAb1E3 with peanut protein， sesame protein， walnut protein and wheat glutenin were less than 0.1%. We successfully prepared the anti-Gly m Bd 28K monoclonal antibodies possessed high sensitivity and specificity. This study provided a basis for the detection of Gly m Bd 28K allergen and the identification of epitopes.

Key words:Gly m Bd 28K; hybridoma cell; monoclonal antibody; indirect ELISA

DOI:10.3969/j.issn.1004-1524.2016.05.06

收稿日期：2015-08-28

基金项目：国家自然科学基金(31301409)；河南工业大学自然科学基础研究培育计划(2014JCYJ01)

作者简介：闫慧丽(1989—)，女，河南郑州人，硕士研究生，从事食品安全与品质控制研究。E-mail: yanhuili2000@163.com

*通信作者，席俊，E-mail: xijunhnu@163.com

中图分类号：S565.1

文献标志码：A

文章编号：1004-1524(2016)05-0748-05

浙江农业学报ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2016，28(5): 748-752

http://www.zjnyxb.cn

闫慧丽，席俊，高学梅，等. 抗Gly m Bd 28K单克隆抗体的制备及其免疫学特性 [J].浙江农业学报，2016，28(5)： 748-752.