泰山磐石散对复发性流产小鼠母胎界面Th1/Th2细胞因子及妊娠预后的影响

许春艳，孙晶



泰山磐石散对复发性流产小鼠母胎界面Th1/Th2细胞因子及妊娠预后的影响

许春艳，孙晶

【摘要】目的：观察泰山磐石散对复发性流产小鼠母胎界面Th1/Th2细胞因子及妊娠预后的影响，为泰山磐石散临床应用提供新的实验依据。方法：采用经典造模方式DBA/2小鼠与CBA/J杂交，获得复发性流产小鼠模型，随机将与DBA/2小鼠合笼的60只CBA/J妊娠小鼠分为模型组、中药低剂量组、中药中剂量组、中药高剂量组和阳性对照组；与BALB/C合笼的10只CBA/J孕鼠作为正常妊娠模型。于妊娠14 d后处死孕鼠，观察小鼠胎盘丢失情况，并提取培养胎界母细胞，24 h后收集细胞上清液，酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测上清液中肿瘤坏死因子α（TNF-α）、γ干扰素（IFN-γ）、白细胞介素4（IL-4）和IL-10含量。结果：经泰山磐石散治疗后，与模型组比较，复发性流产小鼠胎盘丢失率明显改善，母胎界面细胞上清液中Th1型细胞因子IFN-γ明显降低，Th2型细胞因子IL-4、IL-10明显升高，Th1/Th2免疫调节失衡明显改善，以中药高剂量组改善最为明显。结论：泰山磐石散能改善复发性流产小鼠胎盘丢失情况，其具体机制可能是通过调节Th1/Th2免疫调节平衡实现。

【关键词】泰山磐石散；流产，习惯性；细胞因子类；Th1细胞；Th2细胞

作者单位：110032沈阳，辽宁中医药大学附属医院

（J Int Obstet Gynecol，2016，43：214-216）

复发性流产（recurrent spontaneous abortion，RSA）是指与同一性伴侣连续发生3次及3次以上的自然流产，但大多数专家认为连续发生2次流产即应重视并予评估［1］。现代医学研究认为RSA主要病因有内分泌因素、生殖器官异常、遗传因素和感染因素等，但还有大部分患者原因不明，目前研究认为免疫学因素为主要因素之一［2］。中医学并无此病名，将其归属于“滑胎”、“胎漏”等研究范畴，多认为冲任虚损、胎元不固为主要发病机制［3］。泰山磐石散出自《景岳全书》，为治疗本病的常用方药之一，本研究观察本方对RSA小鼠妊娠预后及Th1/Th2的影响，为临床用药提供新的理论依据。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1动物SPF级健康DBA/2雄性小鼠25只，BALB/C雄性小鼠5只，CBA/J雌性小鼠60只，8～10周龄，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，动物合格证号SCXK（京）2012-0001。饲养于辽宁中医药大学SPF级实验动物中心，自由摄食予饮水。

1.1.2试剂和仪器肿瘤坏死因子α（TNF-α）、γ干扰素（IFN-γ）、白细胞介素4（IL-4）、IL-10酶联免疫吸附测定（ELISA）检测试剂盒，购于南京建成生物工程研究所；RPMI-1640培养基购于美国Hyclone公司产品；CO2培养箱：美国，Thermo；酶标仪：奥地利，Anthos2010。

1.1.3药物泰山磐石散由人参3 g、炒当归3 g、白芍3 g、熟地3 g、续断3 g、黄芩3 g、黄芪6 g、白术6 g、糯米6 g、炙甘草2 g、砂仁2 g组成，全部药物均购于辽宁中医药大学附属医院。1.2方法

1.2.1造模于前1晚将CBA/J雌性小鼠（60只）分别与DBA/2（25只）和BALB/C（5只）雄性小鼠合笼，雌雄比为2∶1，次日早晨行阴道涂片和阴栓检查，检查阳性者标记为妊娠第1天，分别建立正常怀孕和自然流产模型，检出孕14 d后处死小鼠。

1.2.2分组、给药及取材与BALB/C合笼的10只CBA/J孕鼠作为正常怀孕模型；与DBA/2合笼的50只CBA/J孕鼠作为自然流产模型。10只CBA/J正常怀孕模型孕鼠作为正常组，50只CBA/J自然流产模型孕鼠按受孕时间先后分别分为模型组、中药低剂量组、中药中剂量组、中药高剂量组和阳性对照组。按照人与动物体表面积换算给药，各组按如下方式处理：中药低剂量组、中药中剂量组、中药高剂量组分别给予泰山磐石散3.43 g/kg、6.86 g/kg、13.71 g/kg灌胃，2次/d；阳性对照组给予黄体酮注射液2 mg/kg腹腔注射，1次/d；正常组、模型组、阳性对照组分别给予等量生理盐水灌胃。各组小鼠分别在孕第1天开始给药。

1.3检测指标及方法

1.3.1胎盘丢失率于孕第14天，处死孕鼠，观察胎盘是否有体积变小和出现组织缺血坏死，若出现上述情况记为胎盘丢失。胎盘丢失率=丢失胎盘数/总胎盘数×100%。

1.3.2ELISA法测定母胎界面细胞培养上清液中TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-10表达水平于孕第14天，处死孕鼠，无菌操作下，打开腹腔，剥离子宫，将胎盘连同蜕膜与子宫分离，磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗，研磨胎盘与蜕膜组织，PBS冲洗，过细胞筛，制成细胞悬液，调节细胞浓度至5×106/mL，取2 mL 置37℃，5%CO2培养箱中培养24 h，收集培养上清液［4］。ELISA检测过程严格按照试剂盒说明书操作。

1.3.3Th1型/Th2型免疫调节平衡指数以IFN-γ代表Th1型免疫调节，IL-4代表Th2型免疫调节，计算IL-4/IFN-γ比值，代表Th1型/Th2型免疫调节平衡指数，当比值大于1时，表明免疫调节平衡向Th2偏移，反之向Th1偏移［5］。

1.4统计学方法采用SPSS 19.0统计软件对数据进行分析。定量资料用均数±标准差（±s）表示，正常组与模型组比较采用两独立样本均数比较的t检验，模型组与中药不同剂量组比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t法，阳性对照组与中药高剂量组比较采用两独立样本均数比较的t检验。定性资料用率表示，组间比较采用χ2检验。P＜ 0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1各组小鼠胎盘丢失率孕14 d后观察小鼠胚胎吸收情况，模型组胎盘丢失率高于正常组，差异有统计学意义（χ2=3.69，P＜0.01）；中药低、中、高剂量组和阳性对照组与模型组比较，胎盘丢失率也降低（χ2分别为3.26，3.18，2.66和4.97，P＜0.05）；而中药高剂量组与阳性对照组的胎盘丢失率比较差异无统计学意义（χ2=0.85，P＞0.05）。见表1。

表1　各组小鼠胎盘丢失率比较

2.2各组小鼠孕14 d母胎界面细胞Th1型/Th2型细胞因子表达及免疫调节平衡情况各组小鼠孕14 d后，与正常组比较，模型组小鼠母胎界面细胞上清液中Th1型细胞因子升高（P＜0.01），Th2型细胞因子降低（P＜0.01）；而与模型组比较，中药中、高剂量组小鼠母胎界面细胞上清液中Th1型细胞因子中IFN-γ降低（P=0.000），中药低、中、高剂量组Th2型细胞因子升高（P＜0.05或P＜0.01），以中药高剂量组最为明显。中药高剂量组与阳性对照组间比较，各项指标差异无统计学意义（均P＞0.05）。

各组小鼠孕14 d后，与正常组比较，模型组小鼠免疫调节平衡明显向Th1型偏移，差异有统计学意义（P=0.000）；经治疗后，与模型组比较，中药不同剂量组免疫调节平衡均有不同程度向Th2型偏移（P＜0.05或P＜0.01）。见表2。

3　讨论

RSA为妇产科常见疾病之一，目前研究认为，免疫因素为较为普遍的因素，占总体发病因素的50%以上［6］。近年来，Th1/Th2型细胞因子免疫调节失衡成为RSA病因的研究热点。本研究选用经典的DBA/2小鼠与CBA/J杂交，获得RSA小鼠模型，观察泰山磐石散对RSA Th1/Th2型细胞因子的影响，为临床治疗提供新的理论依据。中医学认为，本病属于“滑胎”研究范畴，认为脾肾虚弱、冲任不固、气血虚弱为主要病因病机，治疗多采用补肾益气养血、固冲安胎［7］。泰山磐石散为治疗本病的主要方剂之一，诸多古籍对其均有记载，如《医统》卷八十五中记载，泰山磐石散又名安胎散，主治妇人气血两虚，身体素弱，或肥而不实，或瘦而血热，或脾胃少食倦怠，素有堕胎之患；《胎产心法》中记载“凡堕胎之病多在三五七月，如前次三月曾堕，后必如期乘其所虚而亦堕，必预服尊生安胎饮，或胎元饮加减用之，或泰山磐石散、安胎万全神应散等方，对证择用以预防之。”

表2　各组小鼠母胎界面细胞培养上清中Th1型/Th2型细胞因子表达情况　（±s）

表2　各组小鼠母胎界面细胞培养上清中Th1型/Th2型细胞因子表达情况　（±s）

注：t1（P）为正常组与模型组比较；t2（P）为中药高剂量组与阳性对照组比较；F（P）为模型组与中药不同剂量组比较。

组别　n　Th1　Th2　IL-4/IFN-γ IFN-γ（ng/L）　TNF-α（μg/L）　IL-4（μg/L）　IL-10（μg/L）正常组①　10　34.00±4.18　19.84±2.46　101.42±5.09　64.33±5.13　3.03±0.48模型组②　10　95.42±9.08　33.61±2.76　34.45±4.92　29.26±1.99　0.37±0.07 t1（P）　-13.96（0.000）　-8.90（0.000）　22.93（0.000）　16.67（0.000）　12.32（0.000）中药低剂量组③　10　56.35±6.54　24.09±2.61　64.82±5.80　36.28±4.19　1.16±0.13中药中剂量组④　10　49.30±7.34　23.05±1.78　79.21±3.74　42.99±5.25　1.63±0.21中药高剂量组⑤　10　42.06±2.90　24.07±4.26　86.41±8.23　56.14±5.39　2.07±0.31 F（P）　9.198（0.002）　0.207（0.816）　16.849（0.000）　24.423（0.000）　20.678（0.000）组间比t（P）②∶③　1.67（0.130）　-　-4.99（0.001）　-2.30（0.047）　-4.28（0.002）②∶④　5.18（0.000）　-　-5.01（0.001）　-6.86（0.000）　-6.08（0.000）②∶⑤　6.63（0.000）　-　-9.11（0.000）　-6.35（0.000）　-7.51（0.000）阳性对照组⑥　10　39.38±5.98　23.38±2.58　88.29±6.23　62.41±8.41　2.12±0.40 t2（P）　3.27（0.210）　0.37（0.720）　-3.34（0.831）　-1.66（0.123）　-3.14（0.173）

Th1/Th2平衡对于维持正常的妊娠具有重要意义，既往研究认为，正常妊娠是一种特殊的Th2现象，当Th1/Th2平衡偏向Th1，则会导致RSA的发生。Th1型细胞主要分泌IFN-γ和TNF-α等细胞因子，在抗感染等发面发挥重要作用，在妊娠过程中，Th1型细胞对滋养层细胞具有细胞毒性作用而形成免疫损伤，影响胚胎着床，甚至导致流产的发生；Th2型细胞主要分泌IL-4、IL-10等细胞因子，在妊娠过程中，Th2细胞可维持母胎界面的免疫耐受［8］。本研究结果显示，经泰山磐石散治疗后，RSA小鼠胎盘丢失率明显改善，与模型组比较，母胎界面细胞上清液中Th1型细胞因子IFN-γ降低，Th2型细胞因子IL-4、IL-10升高，免疫调节平衡向Th1型偏移。本研究还表明，泰山磐石散对治疗RSA具有显著疗效，以中药高剂量效果最为明显，且与阳性对照药物比较，疗效相当，差异无统计学意义，表明泰山磐石散对RSA作用效果显著，这与既往研究结果相一致［9］。其疗效可能是通过调节Th1/ Th2型免疫调节平衡来实现，具体机制有待进一步探讨。

参考文献

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［9］黎忆梅.泰山磐石散治疗习惯性流产40例［J］.中国医药指南，2013，11（8）：598-599.

［本文编辑秦娟］

产科生理及产科疾病

·综述·

Influence of Taishan Panshi San to Recurrent Spontaneous Abortion Mouse Maternal-fetal Interface Th1/Th2 Cytokines and Pregnancy Prognosis

XU Chun-yan，SUN Jing. Affiliated Hospital of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110032，China

【Abstract】Objective：To investigate the effects of Taishan Panshi San on the maternal-fetal interface Th1/Th2 cytokines and pregnancy outcomes of recurrent abortion mouse，to provide a new experimental basis for clinical application of Taishan Panshi San. Methods：Classic modeling approach DBA/2 mice CBA/J hybridization，get recurrent abortion mouse models，60 CBA/J mice that randomly caged with DBA/2 mice were divided into model group pregnancy，low Chinese medicine dose group，middle Chinese medicine dose group，high Chinese medicine dose group and positive control group；10 pregnant CBA/J mice mated with BALB/C as a normal pregnancy. 14 days after pregnancy pregnant rats were sacrificed to observe the mouse placenta′s missing，and to extract oocytes cultured fetal community，24 hours latter cell supernatants were collected，Elisa assay supernatant TNF-α，IFN-γ，IL-4，IL-10 content. Results：Compare with model group，the recurrent miscarriage mouse placenta loss ratio was significantly improved after treated with Taishan Panshi San，cytokine Th1 and IFN-γ were significantly decreased in cell supernatants of mother-fetal bound，Th2 cytokines IL-4 and IL-10 were significantly increased，Th1/Th2 immunoregulatory imbalance improved significantly，the high dose Chinese tradition medicine group was the most obvious. Conclusions：Taishan Panshi San can significantly improve the placenta lost situation of recurrent abortion mouse，the specific mechanism may be achieved by adjusting the balance of Th1/Th2 immune regulation.

【Keywords】TAISHAN PANSHI POWDERS；Abortion，habitual；Cytokines；Th1 cells；Th2 cells

基金项目：沈阳市科技创新专项资金应用基础研究专项（F14-231-1-15）

通信作者：孙晶，E-mail：sunjing790825@126.com

Corresponding author：SUN Jing，E-mail：sunjing790825@126.com

收稿日期：（2015-09-26）