MicroRNA-145在急性髓系白血病患者中的表达及意义

朱荷艳，李慧慧

(1.南昌大学医学院，南昌 330006；2.南昌大学第二附属医院血液科，南昌 330006)



MicroRNA-145在急性髓系白血病患者中的表达及意义

朱荷艳1，李慧慧2△

(1.南昌大学医学院，南昌 330006；2.南昌大学第二附属医院血液科，南昌 330006)

[摘要]目的探讨MicroRNA-145(miR-145)在急性髓系白血病患者骨髓细胞中的表达情况，并分析其临床意义。方法收集急性髓系白血病患者骨髓标本70例，其中初治组46例、缓解组24例，非血液肿瘤性疾病14例作为对照组。通过实时荧光定量PCR方法检测miR-145的相对表达水平。结果miR-145在初治急性髓系白血病骨髓中表达水平明显低于缓解组及对照组(P<0.01)；其中9例经化疗后缓解的急性髓系白血病患者骨髓miR-145表达水平较治疗前显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)；且miR-145表达水平与初诊时原始细胞百分数及外周血白细胞数均无相关性(P=0.456、0.394)。结论miR-145在急性髓系白血病患者表达下调，提示miR-145的表达与白血病的发生、发展存在显著的关系。

[关键词]急性病；骨髓细胞；白血病；微RNAs；急性髓系白血病；miR-145

急性白血病(acute leukemia，AL) 是一类起源于造血干细胞异常克隆的恶性疾病，异常克隆的干细胞失去进一步分化成熟能力，而停滞于细胞发育的不同阶段，造成骨髓或其他造血组织进行性、失控制地异常增生，抑制造血系统,严重威胁着人类的生存和健康，因此及早诊断并干预这类疾病对挽救生命具有非常重要的临床意义。目前AL的病因及发病机制仍未完全阐明，AL的发病机制是多因素、多基因，甚至是多分子参与的复杂过程。大部分白血病是由于染色体的易位或遗传学异常,导致基因表达异常,引起细胞的增生、分化、凋亡发生异常，从而在正常造血干/祖细胞的恶性转化中发挥重要的作用。

随着人们对生命科学的认识不断加深，作为非编码RNA的重要代表MicroRNA(miRNAs)受到越来越多的青睐。miRNAs为一长度大约22个碱基的小RNA分子，它通过和编码蛋白质的mRNA互补结合，抑制其表达，从而起到调控细胞的分化、生长、发育、增殖、代谢、凋亡等功能[1-4]，并通过与靶mRNA3′端完全或不完全的互补结合，抑制靶mRNA翻译或诱导靶mRNA降解在转录后水平调控基因表达，影响细胞的增殖、分化和凋亡[5-6]，参与肿瘤的发生、发展及侵袭转移。miRNAs不仅与人类多种肿瘤的发生、发展有关，且与肿瘤的侵袭转移密不可分，因此miRNAs可能成为一类新的致癌基因或抑癌基因。miR-145是miRNA家族中的成员之一,被认为是一种肿瘤抑制基因，可以靶向多个肿瘤相关基因,从而影响肿瘤的生长、侵袭转移，以及肿瘤血管的生成。目前，关于miR-145在急性髓细胞白血病(AML)中的表达情况研究甚少，本研究应用荧光定量PCR技术检测miR-145在AML患者中的表达情况，旨在揭示miR-145在AML中的表达特点并分析其临床意义。

1资料与方法

1.1一般资料所有病例为2013年10月至2014年9月在南昌大学第二附属医院血液科住院治疗的患者，参照张之南主编《血液病诊断及疗效标准(第三版)》[7]诊断标准确诊为AML，共收集患者46例为初治组，男24例，女22例，年龄16～70岁，按FAB分型M16例，M211例，M311例，M47例，M56例，M65例。缓解组24例，男10例，女14例，年龄16～70岁，按FAB分型M11例，M29例，M36例，M43例，M52例，M63例。同期收集在该院治疗并进行骨髓穿刺检查的非血液系统肿瘤性疾病患者14例为对照组，男8例，女6例，年龄20～55岁。所有患者均签署知情同意书。

1.2方法

1.2.1标本处理所有入选者在进行骨髓穿刺后，留取新鲜骨髓2～4 mL，置于EDTA管中；提取单个核细胞，采用Trizol法提取RNA，提取RNA后取2 μL在核酸蛋白定量测定仪上侧光密度(OD)值，进行准确定量。

1.2.2逆转录按TaKaRa公司试剂盒Code NO.RR718提供的使用说明书操作，20 μL的逆转录反应体系包括2×miRNA Reaction Buffer Mix 10 μL,0.1%BSA 2 μL,miRNA PrimeScript RT Enzyme Mix 2 μL,Total RNA 2 μL,RNase Free dH2O 4 μL。反应条件为：37 ℃ 60 min,85 ℃ 5 s，4 ℃保持；反应产物于-20 ℃保存备用。

1.2.3引物设计与合成运用引物设计软件Premier 5.0设计定量PCR引物，引物序列确定后交由上海生工工程股份有限公司合成。

1.2.4实时定量PCR构建miR-145和U6的荧光定量PCR反应总体系为25 μL。包括SYBR premix Ex Taq Ⅱ 12.5 μL，ROX Reference DyeⅡ 0.5 μL，cDNA 2 μL,正向和反向引物各1 μL,RNase Free dH2O补足至25 μL。使用ABI7300全自动实时定量PCR仪进行检测，反应扩增条件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 31 s，40个循环。实时定量反应中，同时扩增miR-145和U6基因，每一样本的miR-145和U6基因检测重复3次，以保证其结果的准确性。采用比较Ct值方法定量miR-145表达水平的变化，将各样本的miR-145的Ct值与U6的Ct值相减，即△Ct=miR-145平均Ct值-U6平均Ct值,取其均值，计算其相对表达2-△△Ct，并比较其差异。

1.3统计学处理采用SPSS17.0统计学软件处理数据。计量资料呈非正态分布或方差不齐,所有数据均采用中位数(范围)表示。采用Mann-whitney U秩和检验比较3组间miR-145表达水平的差异，并对miR-145表达水平与骨髓原始细胞比例、外周血白细胞水平相关性分析行Spearman相关性检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1miR-145的相对表达量在3组间的比较miR-145在AML各组相对表达水平呈偏态分布：初治组表达为0.560(0.139,1.676)、缓解组表达为5.712(2.951，11.286)、对照组表达为14.547(6.223,30.012)。初治组miR-145表达水平明显低于缓解组及对照组，差异有统计学意义(P<0.01)；缓解组低于对照组，差异有统计学意义(P=0.012)，见图1。

图1　miR-145相对表达水平组间比较对比图

2.2miR-145在亚型中表达的差异46例AML患者中miR-145的相对表达水平M3型表达为0.639(0.311,1.296)，非M3型表达为0.545(0.135,1.884)，差异无统计学意义(P=0.887)。

2.3miR-145与临床的相关性分析初诊AML患者中miR-145表达水平与初诊时骨髓原始细胞百分数、初诊时外周血白细胞数均无相关性(r=-0.113，P=0.456；r=-0.129，P=0.394)。

2.4白血病患者缓解前后miR-145的表达水平通过检测9例的初治白血病患者与其第1次缓解后骨髓中miR-145的表达水平发现，缓解后比初治时miR-145的表达水平明显上调(P<0.05)。

3讨论

近年来，随着环境污染的加剧，白血病发病率呈逐年上升的趋势。白血病是一种由造血干细胞或祖细胞突变引起的造血系统恶性肿瘤，其发生、发展是一个多因素、多步骤的复杂过程。miRNAs是一类短链RNA分子,由内源基因编码,主要功能是负性调节靶基因的表达。每一个miRNA可以有多个靶基因，一个基因也可以由几个miRNAs共同调控。生物信息学家预测miRNAs可能调控50%～60%的人类编码蛋白基因[8-9]。部分miRNAs不仅具有肿瘤抑制基因功能，而且还具有肿瘤基因功能。miRNA在正常细胞和恶性肿瘤细胞中表达不同，且几乎所有的肿瘤都存在miRNA的异常表达。miRNAs异常表达与不同类型的肿瘤发生及进展密切相关[8,10-14]。研究发现胃癌患者血浆中miR-451和miR-486的表达较健康人相比明显增高[15],术后血浆中表达明显降低，因此miR-451和miR-486可以作为筛查胃癌的有用生物标志物。miRNAs可能成为一类新的致癌基因或抑癌基因，其通过抑制靶mRNA翻译或诱导靶mRNA降解在转录后水平调控基因表达，参与肿瘤的发生、发展及侵袭转移。

miR-145定位于5号染色体(5q32-33),在人类的胚胎发育过程中，起源于中胚层的组织或器官，其表达量较为丰富[16]。其染色体附近的5q31.1是一个极为重要的脆性位点。脆性位点是部分抑制DNA的合成后,发生在中期染色体上的特异性缺口或断裂区域。脆性位点在体细胞中一般较稳定,而在大多肿瘤细胞中却经常出现缺失或重排的现象。miR-145被认为是一种肿瘤抑制基因，其可能以通过与胰岛素受体底物-1(IRS-1)基因的3′-UTR的结合从而下调IRS-1蛋白达到抑制肿瘤细胞生长[17]，从而抑制肿瘤的作用；也可能通过直接作用于c-Myc基因使肿瘤细胞阻滞于G1期、细胞凋亡率增加，细胞生长受抑制，通过作用于促凋亡线粒体蛋白BNIP-3抑制肿瘤的发生、发展[18]，因此miR-145与癌症的发生关系密切。目前，国内外关于miR-145在血液肿瘤中的研究较少，二者的相关性有待于进一步的研究。

本试验通过对46例初发成人AML患者、24例完全缓解期患者及14例对照组骨髓中 miR-145的表达量进行检测，研究结果发现，miR-145在不同分组间的表达水平不同，初诊AML患者miR-145表达水平明显低于缓解组及对照组，差异有统计学意义(P<0.01)。其中检测9例的初治白血病患者与其第1次缓解后骨髓中miR-145的表达水平发现，经治疗后这些患者的miR-145的表达水平明显上调，但仍低于对照组。这些结果表明，miR-145在AML中呈现低表达现象，且其表达水平与疾病状态可能有关。目前研究发现miR-145在多种肿瘤组织中表达下调,如乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、肺癌B细胞淋巴瘤等[19]，与本研究结果相似，这可能是miR-145在白血病的发生过程中担任了抑癌基因的角色，一定程度上可以衡量疾病的进展程度，提示miR-145的表达水平可能与白血病的发生、发展及临床预后有关。

本研究通过比较发现，miR-145表达水平与初诊时骨髓原始细胞百分数、初诊时外周血白细胞数及疾病分型均无相关性。初步揭示了miR-145的表达与AML的相关性，miR-145在AML及健康人骨髓中呈现差异性表达，提示miR-145与白血病的发生、发展存在着非常密切的关系，然而产生的差异及作用机制有待于进一步的研究。随着研究的深入，miR-145骨髓表达水平可能成为AML的诊断及化疗敏感性检测的一种生物标记物。

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Expression and significance of miR-145 in acute myeloid leukemia

ZhuHeyan1,LiHuihui2△

(1.MedicalCollegeofNanchangUniversity,Nanchang,Jiangxi330006,China；2.DepartmentofHematology,theSecondAffiliatedHospitalofNanchangUniversity,Nanchang,Jiangxi330006,China)

[Abstract]ObjectiveTo research the expression and clinical significance of miR-145 in the marrow of acute myeloid leukemia (AML).MethodsA total of 70 cases of bone marrow samples were collected from AML patients，of which included 46 cases of new diagnosed patients(initial treatment group)，24 cases of AML patients in complete remission(remission group).Fourteen cases of non-neoplastic patients were used as controls(control group).The miR-145 relative expression level was detected by real-time quantitative PCR.ResultsThe relative expression level of miR-145 in initial treatment group was less than those of control group and remission group(P<0.01).Compared to before-chemotherapy patients,the expression level of miR-145 in the 9 case of AML patients with complete remission after chemotherapy increased significantly(P<0.05).The relative expression of miR-145 showed no significantly correlation with the percentage of blasts cells in bone marrow and the percentage of peripheral blood leukocyte count(P=0.456，0.394).ConclusionThe expression of miR-145 in bone marrow cells of AML patients is down-regulated,which suggested the development of acute leukemia.

[Key words]acute disease；bone marrow cells；leukemia；microRNAs；acute myeloid leukemia；miR-145

作者简介：朱荷艳(1986-)，在读硕士，主要从事血液内科临床及基础研究。△通讯作者，E-mail:lihuihui198707@163.com。

doi:论著·临床研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.03.028

[中图分类号]R-33

[文献标识码]A

[文章编号]1671-8348(2016)03-0377-03

(收稿日期：2015-08-28修回日期：2015-10-22)