降浊颗粒对慢性肾衰大鼠肠道IgA的改善作用研究*

王　坚，王　清，吉　勤

(1.云南省第一人民医院肾内科，昆明 650032；2.云南中医学院中医内科教研室，昆明 650500；3.云南中医学院第一附属医院肾内科，昆明 650031)



降浊颗粒对慢性肾衰大鼠肠道IgA的改善作用研究*

王坚1，王清2△，吉勤2

(1.云南省第一人民医院肾内科，昆明 650032；2.云南中医学院中医内科教研室，昆明 650500；3.云南中医学院第一附属医院肾内科，昆明 650031)

[摘要]目的采用5/6肾切除法建立大鼠慢性肾衰动物模型，以中药复方剂“降浊颗粒”治疗，观察并评价其对CRF肠道免疫功能的影响。方法Wistar大鼠造模后分为降浊颗粒高、中、低剂量组，贝那普利组，假手术组，模型对照组，分别给予降浊颗粒4.05、8.10、16.20 g·kg-1·d-1及贝那普利1.2 mg·kg-1·d-1灌胃，假手术组及模型对照组予生理盐水2 mL·kg-1·d-1灌胃,疗程60 d。观察治疗前后肌酐、尿素氮变化，同时测定血清及肠道SIgA水平，以及mRNA及蛋白表达。结果贝那普利组、降浊颗粒各剂量组血清BUN、Scr水平明显低于模型对照组(P<0.05)；ELISA、蛋白表达与RT-PCR结果比较，贝那普利组、降浊颗粒各剂量组与模型对照组比较，肠道IgA蛋白和mRNA表达显著升高(P<0.05)，降浊颗粒高、中剂量组与贝那普利组比较，明显升高(P<0.05)。结论降浊颗粒有独立于具有改善肾功能的作用，此外对CRF肠道免疫功能也有一定的改善作用。

[关键词]肾功能衰竭,慢性；中药疗法；降浊颗粒；肠道免疫功能

降浊颗粒是我国古典中药学的精华，其方剂出于《金匮要略》，本研究通过动物实验，观察降浊颗粒治疗5/6肾切除CRF大鼠后，其肠道局部分泌型免疫球蛋白(SIgA)的变化规律，以揭示药物对CRF合并消化道症状治疗作用的机理，为今后临床中治疗本病提供可靠的科学依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1药物和试剂盒降浊颗粒购于云南理想药业有限公司；盐酸贝那普利(洛丁新)购于北京诺华制药有限公司；大鼠黏膜局部抗体(IgA)及SIgA检测酶联免疫吸附剂测定(ELISA)试剂盒，购于苏州卡尔文生物科技有限公司。

1.1.2实验动物清洁级雄性Wistar大鼠120只[动物合格证号:SCXK(川) 2010-15]，大鼠体质量为(200±20)g，购于四川省医学科学院实验动物研究。大鼠放置于代谢笼内进行饲养，造模前经检查所有大鼠均无蛋白尿。

1.1.3主要仪器台式高速离心机(GT16-3)为北京时代北利离心机有限公司生产；酶标仪(MULTESKAN MK3)为Thermo公司生产；隔热式电热恒温培养箱(DHP-420)为北京市光明医疗仪器厂生产；电热恒温鼓风干燥箱(DHG-9101)为上海鸿都电子科技有限公司生产；立式压力蒸汽灭菌器(LDZX-50KBS)为上海申安医疗器械厂生产；SZ系列自动纯水蒸馏器为上海亚荣生化仪器厂生产。

1.2方法

1.2.1动物模型制作麻醉后以大鼠肋脊角为标志，其左侧背部做2～3 cm切口，充分暴露左侧肾脏，剥离周围脂肪及肾包膜，止血钳夹住肾动脉，切除2/3肾充分止血后甲硝唑注射液冲洗伤口，缝合腹腔。1周后同法切除右肾。假手术组方法相同，但不切除肾。

1.2.2动物分组与处理造模时，选择17只大鼠作为假手术组，其余103只经肾5/6切除术建立CRF大鼠模型(手术组)。103只大鼠经造模，死亡13只，存活90只。存活的大鼠选取10只处死，观察大鼠肾脏苏木素-伊红(HE)染色；其余80只则分为降浊颗粒高剂量组、降浊颗粒中剂量组、降浊颗粒低剂量组、贝那普利组，以及模型对照组，每组分别为16只。

1.2.3给药方法降浊颗粒低、中、高剂量治疗组分别给予降浊颗粒4.05 g·kg-1·d-1、8.1 g·kg-1·d-1，以及16.2 g·kg-1·d-1。贝那普利治疗组给予1.2 mg·kg-1·d-1贝那普利悬液灌胃治疗；模型对照组及假手术组给予生理盐水2 mL·kg-1·d-1灌胃。治疗时间60 d。

1.2.4标本采集与处理各组动物在末次给药后禁食及禁水12 h。实验时每只动物用抗凝试管中预先加入0.3 mol/L 60 μL的乙二胺四乙酸(EDTA)及60 μL的抑肽酶，取血3～5 mL，置于冰水中，于4 ℃下4 000 r/min分离20 min，取血清后分装，-78 ℃保存待测。脱颈椎处死大鼠，自距肛门2 cm以上称取100 mg肠组织，用9倍的磷酸盐缓冲液(PBS)匀浆，3 000 r/min离心20 min，取上清液-80 ℃保存，待测肠道SIgA。取残余肾组织，用10%福尔马林固定,待病理检测。

1.2.5检测内容及方法

1.2.5.1血清尿酶法检测血清尿素氮(BUN)、苦味酸法检测血清肌酐(Scr)、ELISA 法测定SIgA，具体操作流程完全按照试剂盒说明。

1.2.5.2组织检测肾组织石蜡切片行HE染色，观察肾组织肾小球系膜细胞增殖、肾小球硬化和肾小管损害程度。肠组织ELISA法测定IgA。标本检测由云南省重点高校口腔医学重点实验室进行检测。

1.2.5.3逆转录PCR(RT-PCR)检测mRNA的表达从低温冰箱中取出肝脏组织，用微量天平称取30 mg，称取后立即用总RNA提取试剂盒提取总RNA，提取总RNA后立即定量，定量后每组各取2 μg逆转录cDNA，其余总RNA置于超低温冰箱保存，用逆转录试剂盒提供的配置液行PCR反应扩增，PCR扩增的条件完全按照引物说明书进行，目的片段扩增后在110 V、1 μL GeneFinder，以及1.6%琼脂糖凝胶中电泳30 min，电泳完成后用凝胶成像仪拍照收集条带图像，采集图像后用Image J计算各条带荧光值，全部试验均用β-actin作内参，每组实验重复3次。

1.2.5.4Western Blot检测蛋白表达称取肝脏组织100 mg，称取后立即放入组织裂解液，电动匀浆机制作匀浆，匀浆液磨好后，4 000 r/min离心，收集上清液，BCA法定量，定量后取各样本60 μg进行聚丙烯酰胺凝电泳，其余流程均按照常规方法操作，暗室内与ECL发光试剂反应，曝光洗片，扫描图像后用Image J计算各条带荧光值，全部试验均用β-actin作内参，每组实验重复3次。

2结果

2.1一般情况造模成功后，手术组进食量明显少于假手术组，治疗后大鼠进食有所恢复，但依然少于假手术组；假手术组鼠毛润泽度明显好于手术组，手术组大鼠鼠毛无光泽，有耸毛现象，同时卷曲弓背，精神萎靡，懒于活动；贝那普利组和降浊颗粒各组经过治疗后，其大鼠活动有所增加，但鼠毛变化不大。

给药期间，假手术组无死亡，模型对照组死亡3只，贝那普利组死亡1只，降浊颗粒高剂量组死亡1只。降浊颗粒中剂量组死亡2只，降浊颗粒低剂量组死亡2只。各组动物病死率差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2造模成功后大鼠肾脏HE染色随机选取手术组大鼠10只，做肾病理HE染色，均发现部分肾小球硬化，部分肾小球代偿性肥大，广泛肾小管萎缩及间质纤维化等表现，见图1。

A、B：正常肾小球；C：肾小管固缩性坏死、纤维化；D：肾小管坏死、扩张、管型。

图1HE染色结果(×100)

2.3切除术7周后大鼠肾脏BUN、Scr比较手术组大鼠BUN、Scr明显增高，与假手术组比差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1　5/6肾切除术后7周Scr、BUN的变化

a:P<0.05，与假手术组比较。

2.4血生化检查治疗后各组大鼠Scr、BUN情况见表2。

2.5血清SIgA及肠道IgA检查各组间血清SIgA差异无统计学意义(P>0.05)；贝那普利组、降浊颗粒各剂量组与模型对照组比较，贝那普利组、降浊颗粒各剂量组肠道IgA明显升高(P<0.05)；与贝那普利组比较，降浊颗粒高、中剂量组肠道IgA显著升高(P<0.05)，见表3。

2.6肠道IgA mRNA表达肠道IgA mRNA表达结果显示，贝那普利组、降浊颗粒各剂量组与模型对照组比较，贝那普利组、降浊颗粒各剂量组肠道IgA mRNA表达明显升高(P<0.05)；与贝那普利组比较，降浊颗粒高、中剂量组肠道IgA mRNA表达显著升高(P<0.05)，见图2。

表2　治疗结束时各组大鼠

a:P<0.05，与假手术组比较；b:P<0.05，与模型对照组比较。

2.7肠道IgA蛋白表达肠道IgA蛋白表达结果与mRNA表达结果基本一致，贝那普利组、各治疗组与模型对照组比较，贝那普利组、降浊颗粒各剂量组IgA蛋白表达明显升高(P<0.05)；与贝那普利组相比，降浊颗粒高、中剂量组肠道IgA蛋白表达也显著升高(P<0.05)，见图3。

表3　治疗结束时各组大鼠SIgA及肠道IgA情况±s)

a:P<0.05，与假手术组比较；b:P<0.05，与模型对照组比较；c:P<0.05，与贝那普利组比较。

a:假手术组；b:模型对照组；c:贝那普利组；d:降浊颗粒高剂量组；e:降浊颗粒中剂量组；f：降浊颗粒低剂量组。*：P<0.05，与模型对照组比较；#：P<0.05，与贝那普利组比较。

图2治疗后大鼠肠道提取液IgA mRNA表达

a:假手术组；b:模型对照组；c:贝那普利组；d:降浊颗粒高剂量组；e:降浊颗粒中剂量组；f：降浊颗粒低剂量组。*：P<0.05，与模型对照组比较；#：P<0.05，与贝那普利组比较。

图3治疗后大鼠肠道提取液IgA蛋白表达

3讨论

国外已有多项研究表明，贝那普利对多种病因所致的慢性肾功能不全患者具有一定的肾功能保护作用[1-3]。本次动物实验进一步证实了降浊颗粒可改善肾功能，其作用与贝那普利基本相当。

CRF时肠道屏障功能是受损的[4-5]，肠道黏膜屏障功能受损又会反作用使得CRF病情加重[6]，这主要是肠道黏膜屏障的受损会使得肠道内的细菌特别是内毒素易位，内毒素的异位可导致单核巨噬细胞系统激活，进而促进其表达大量的炎性介质、有害细胞因子、蛋白酶类,以及氧自由基等，上述因子的释放加重了CRF患者的炎症状态，最终使得疾病加重[7]。所以研究CRF患者肠道免疫屏障功能的变化，寻找可以调节肠道免疫屏障功能的方法，在CRF患者治疗中有非常重要的意义。IgA是肠道黏膜表面的第一道免疫防线，同时也可以作为评价肠道受损的指标，研究和探讨肾功能不全患者肠道黏膜屏障功能受损中肠道IgA的表达具有风向标的意义。

本研究表明，造模后大鼠血清SIgA虽然差异无统计学意义，但肠道IgA表达明显降低(P<0.05)，提示CRF时肠道免疫屏障确实有损伤。分析该病导致肠道IgA减少的原因可能为大鼠肾脏功能的受损导致其代谢产物排泄减少，代谢产物的减少导致其在血液中过度堆积，最终导致其经肠黏膜排人肠腔，为肠道细菌提供了丰富的氮源，使肠道菌群过度生长，造成菌群失调。而肠道菌群紊乱直接影响IgA的合成[8-9]。而经过治疗后，无论是贝那普利组还是各治疗组肠道IgA水平均有明显升高(P<0.05)，推测随着肾功能的改善，CRF大鼠的肠道免疫功能也有所改善。但值得注意的是降浊颗粒中、高剂量组肠道SIgA明显高于贝那普利组，说明降浊颗粒本身具有明显改善CRF肠道免疫屏障功能作用，且这种作用与剂量相关。推测可能因为该药配方中的益气健脾的成分，尤其是大黄、人参具有减少自由基产生，全面提高免疫功能，增强网状内皮系统功能，促进IgG、IgA、IgM生成及淋巴细胞的转化的作用[10-13]。

综上所述，降浊颗粒不仅独立于具有改善肾功能的作用，对CRF肠道免疫功能也有一定的改善作用。

参考文献

[1]Hebert LA.Optimizing ACE-inhibitor therapy for chronic kidney disease[J].N Engl J Med,2006,354(2):189-191.

[2]Siragy HM.Major outcomes in high-risk hypertensive patients randomized to angiotensin-converting enzyme inhibitors or calcium channel blocker vs diuretic.The antihypertensive and lipid-lowering treatment to prevent heart attack trial(ALLHAT)[J].Curr Hypertens Rep,2003,5(4):293-294.

[3]Anderson S,Meyer TW,Rennke HG,et al.Control of glomerular hypertension limits glomerular injury in rats with reduced renal mass[J].J Clin Invest,1985,76(2):612-619.

[4]Turner JR.Intestinal mucosal barrier dysfanction in disease[J].Nat Rev Immunol,2009,9(11):799-809.

[5]Catalioto RM,Maggi CA,Giuliani S.Intestinal epithelial barrier dysfunction in disease and possible therapeutical interventions[J].Curr Med Chem,2011,18(3):398-426.

[6]BerkesJ,ViswanathanVK,SavkovicSD,

et al.Intestinal epithelial responses to enteric pathogens:effects on the tight junction barrier,ion transport,and inflammation[J].Gut,2003,52(3):439-451.

[7]Bobrov VA,Karpov PF.Microecological disorders in the intestines of patients with chronic kidney failure and the arterial hypertension syndrome[J].Ter Arkh,1993,65(6):41-43.

[8]Hooper LV,Wong MH,Thelin A,et al.Molecular analysis of commensal host-microbial relationships in the intestine[J].Science,2001,291(555):881-884.

[9]Kavukçu S,Türkmen M,Soylu A,et al.Intestinal urea metabolism:could the bacteria involved in Nitrogen cycle lead to reutilization of intestinal urea Nitrogen in uremic rabbits?[J].J Nutr Sci Vitaminol(Tokyo),2002,48(1):24-29.

[10]雷萍，关洪全，王昊，等．不同产地人参水煎剂对免疫抑制小鼠细胞免疫功能的影响[J]．中国实验方剂学杂志，2011，17(8)：218-220．

[11]胡彦武．东北刺人参茎对免疫力低下小鼠免疫功能的影响[J]．安徽农业科学，2011，39(2)：780-781．

[12]蔡长茂，李威．大黄防治胃肠黏膜屏障损伤的研究进展[J]．现代生物医学进展，2010，10(2)：376-378．

[13]张雪侠，苗明三．机体肠道免疫和药物调节[J]．中医学报，2012，27(6)：766-769．

The influence of Turbidity-reducing Granule on the intestinal immune function of rats with chronic renal failure*

WangJian1，WangQing2△，JiQin2

(1.DepartmentofNephrology,theFirstPeople′sHospitalofYunnan,Kunming，Yunnan650032,China；.DepartmentofInternalMedicine,YunnanUniversityofT.C.M,Kunming,Yunnan650500,China;3.DepartmentofNephrology,theFirstAffiliatedHospitalofYunnanT.C.MUniversity,Kunming,Yunnan650031,China)

[Abstract]Objective To establish a rat model of chronic renal failure (CRF) by using 5/6 subtotal nephrectomy method,then observe and evaluate the effect of Turbidity-reducing Granule on the intestinal immune function of rats with CRF.MethodsCRF model Wistar rats were divided into high,medium and low dose group,sham operation group,and model control group.respectively given Turbidity-reducing Granule 4.05,8.10,16.20 g·kg-1·d-1.Benazepril group was given 2 mL/d (1.2 mg/d) Benazepril suspension fed;model control group and the sham group are saline 2 mL/d orally.The rats were observed before and after treatment of signs and general condition,serum BUN,Scr changes,and pathological changes were observed under microscope.ELISA method were used to detect serum and intestinal SIgA.ResultsTurbidity-reducing Granule reduced the level of serum BUN,Scr in rats with CRF,there were statistically significant differences of Benazepril group and high,medium,low dose of Turbidity-reducing Granule group compared with model group(P<0.05).Compared with the model group,the intestinal SIgA of Benazepril group and low,middle,high dose of group increased significantly(P<0.05);intestinal SIgA in,middle and high dose group were significantly increased compared with Benazepril group(P<0.05).ConclusionTurbidity-reducing Granule could improve renal function and intestinal immune function.

[Key words]kidney failure,chronic；drug therapy(TCD)；Turbidity-reducing Granule；intestinal IgA

doi:论著·基础研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.03.013

基金项目:2013年云南省自然科学基金(2011FZ258)。

作者简介：王坚(1968-)，副主任医师，硕士，主要从事慢性肾功能不全及血液净化研究。△通讯作者，E-mail:1020379537@qq.com。

[中图分类号]R453.9

[文献标识码]A

[文章编号]1671-8348(2016)03-0329-03

(收稿日期：2015-08-22修回日期：2015-10-21)