非小细胞肺癌组织中VEGF和Bax的表达及意义

曹文荣,闫文修,王雪利

(山东省青岛市第八人民医院病理科　266100)



非小细胞肺癌组织中VEGF和Bax的表达及意义

曹文荣,闫文修,王雪利

(山东省青岛市第八人民医院病理科266100)

[摘要]目的观察非小细胞肺癌(NSCLC)中血管内皮生长因子(VEGF)和Bax的表达，并探讨其临床应用价值。方法收集该院NSCLC患者肺组织石蜡标本80例(NSCLC组)及良性病变病灶旁正常肺组织石蜡标本20例(对照组)，采用Western blot和免疫组织化学染色(SP)法测定NSCLC组织中VEGF和Bax的表达，并探讨二者与NSCLC病理类型、TNM分期及淋巴结转移的相关性。结果NSCLC组中VEGF阳性表达显著高于对照组，Ⅲ～Ⅳ期VEGF阴性表达高于Ⅰ～Ⅱ期，有淋巴结转移组织中的VEGF阳性表达高于无淋巴结转移组织，差异均有统计学意义(P<0.05)；VEGF的表达与腺癌、鳞癌无相关性(P>0.05)。NSCLC组中Bax表达低于对照组，Ⅲ～Ⅳ期Bax阳性表达低于Ⅰ～Ⅱ期，有淋巴结转移组织中Bax阳性表达低于无淋巴结转移组织，差异均有统计学意义(P<0.05)；Bax的表达与腺癌、鳞癌无相关性(P>0.05)。NSCLC中VEGF和Bax的表达呈负相关。结论VEGF的表达在NSCLC中起着促进作用，并与Bax表达呈负相关，二者的表达可为NSCLC的诊断及预后提供判断依据。

[关键词]癌,非小细胞肺；淋巴转移；血管内皮生长因子A；bcl-2相关X蛋白质

肺癌是目前世界上病死率位居第一位的恶性肿瘤。全国恶性肿瘤死亡第一位的也是肺癌，且发病率和病死率上升最快，病死率最高者男女均为肺癌[1]。目前治疗肺癌的主要方式是手术治疗，比较认可的手术原则是尽量最大限度地保留肺组织，彻底切除病灶及转移肺组织，从而改善预后。但是目前早期诊断水平有限和患者早期症状不明显，确诊时肿瘤仍局限于原发部位的只有16%，75%的肺癌确诊时已有区域转移(5年生存率为20.6%)或远处转移(5年生存率为2.8%)[2]。而淋巴结受累或转移情况直接影响到患者术后的复发率及长期生存率，从而影响外科手术的治疗效果。

在肺癌人群中，非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)约占85%。NSCLC主要包括腺癌、鳞癌、大细胞癌三大类型。肺癌扩散的主要途径是淋巴结转移，其转移情况也是肺癌TNM分期的主要依据，是影响预后的重要因素。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)与淋巴管的生成及转移密切相关[3]。Bax与NSCLC发生发展及转移密切相关。因此本研究应用Western blot和免疫组织化学染色(SP)法测定NSCLC组织中VEGF和Bax的表达，探讨二者与NSCLC病理类型、TNM及转移的相关性，为NSCLC的临床治疗和预后提供判断指标。

1材料与方法

1.1材料收集本院NSCLC患者肺组织石蜡标本80例作为NSCLC组，其中男54例，女36例，年龄49～71岁，平均年龄58岁，淋巴转移者45例，无淋巴转移者35例。根据2002国际抗癌协会TNM分期标准对病例进行临床分期。鳞癌49例，腺癌31例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期58例，Ⅲ～Ⅳ期22例。收集肺良性病变病灶旁正常肺组织石蜡标本20例，作为对照组。

1.2方法

1.2.1Western blot 测定各组织中VEGF和Bax的表达裂解组织并收获蛋白。根据BCA试剂盒对蛋白浓度进行测定。蛋白样品上样，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS)凝胶电泳分离，湿法砖膜。一抗孵育，4 ℃过夜；二抗室温孵育1～2 h。漂洗，滴加ECL曝光液，在凝胶成像系统中曝光。用“Quantity one”软件对各抗体条带灰度值进行统计。

1.2.2免疫组织化学染色(SP)法测定各组织中VEGF和Bax的表达10%甲醛溶液固定组织，石蜡包埋，切片，抗原修复，室温冷却，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗，一抗室温孵育，PBS冲洗，二抗37 ℃孵育，PBS洗涤，DAB溶液显色后冲洗、复染、脱水、透明、树胶封片。以PBS液代替一抗作为阴性对照。

1.2.3结果判断VEGF和Bax蛋白染色阳性主要定位于细胞质，采用半定量计分法判定，高倍镜下随机选择10个视野，分别计算500个肿瘤细胞。切片中阳性细胞小于5%为0分，6%～25%为1分，>25%～50%为2分，>50%～75%为3分，>75%为4分；染色深度以无阳性细胞为0分，淡黄色为1分，黄色为2分，棕黄色或棕褐色为3分，免疫反应的总得分为阳性细胞百分率与免疫染色强度总得分的乘积。

2结果

2.1NSCLC组及对照组中VEGF和Bax表达NSCLC组的VEGF表达显著高于对照组(P<0.01)，其中鳞癌组织中30例高表达，腺癌组织23例高表达；NSCLC组的Bax表达低于对照组(P<0.01)，其中鳞癌组织中15例高表达，腺癌组织12例高表达，见图1、表1。

a:P<0.01，与对照组比较。

图1NSCLC组与对照组中VEGF和Bax表达

2.2不同病理类型NSCLC组织中VEGF和Bax表达VEGF和Bax的表达在鳞癌、腺癌中差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

2.3不同TNM分期NSCLC组织中VEGF和Bax表达Ⅲ～Ⅳ期NSCLC组织中VEGF的表达显著高于Ⅰ～Ⅱ期，Ⅲ～Ⅳ期NSCLC组织中Bax的表达显著低于Ⅰ～Ⅱ期，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

2.4有无淋巴结转移的NSCLC组织中VEGF和Bax表达有淋巴结转移的NSCLC组织中VEGF的表达高于无淋巴结转移的NSCLC组织，有淋巴结转移的NSCLC组织中Bax的表达低于无淋巴结转移的NSCLC组织，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表1　不同病理类型肺癌组织中VEGF和Bax表达[n(%)]

表3　有无淋巴结转移的NSCLC组织中VEGF

2.5VEGF和Bax表达的相关性经Pearson相关性分析，NSCLC组织中VEGF和Bax表达负相关(r=-0.492，P<0.01)。

3讨论

随着手术治疗，化疗，放疗及生物治疗不断推进，NSCLC的治疗已经有了很大的进步，但目前5年生存率不足15%。其主要原因是诊断NSCLC时，发现1/3以上肿瘤发生了远处转移，术后转移复发较多[1]。报道称，约有50%完全切除的NSCLC患者因远处转移而治疗失败[2]。而淋巴结转移是肿瘤转移的主要方式，对NSCLC临床病理分期、患者预后判断及选择针对性的治疗具有重要的临床意义。

VEGF可通过诱导内皮细胞增殖和淋巴管生长，促进膀胱癌、皮肤恶性黑色素瘤、舌鳞状细胞癌、胃癌等肿瘤的淋巴转移，表明其表达可作为一个临床指标对预后进行评估[4]。Hu等[5]，Brussino等[6]研究发现NSCLC组织中VEGF阳性表达量显著高于正常组织，本实验也发现VEGF在NSCLC中阳性表达高于正常组织，说明VEGF与NSCLC的发生有关。Liu等[7]，刘东华等[8]等研究进一步证实Ⅲ～Ⅳ期NSCLC组织中VEGF的阳性表达显著高于Ⅰ～Ⅱ期，本研究也证实了此观点，说明VEGF跟NSCLC临床TNM分期有关系。Hao 等[9]研究证实VEGF与NSCLC的淋巴管生成和淋巴结转移密切相关。VEGF在受到肿瘤侵犯边缘的表达与NSCLC患者的淋巴结转移与淋巴结侵犯有密切的关系[10]。本研究中同样也观察到VEGF在有淋巴结转移肺组织中高表达，与无淋巴结转移肺组织对比，差异有统计学意义(P<0.05)。说明NSCLC组织中VEGF的表达与淋巴结转移密切相关。RNA 干扰介导的 VEGF沉默能抑制NSCLC组织的生长和转移[11]。进一步说明，通过调节VEGF的表达能显著影响NSCLC组织的生长及转移，可作为NSCLC治疗的一个新的靶点。同时在本研究中VEGF在腺癌、鳞癌中的表达差异无统计学意义(P>0.05)，说明肺癌组织中VEGF的表达与病理类型无关，在以VEGF为靶点对NSCLC进行干预治疗时，无需考虑组织病理类型。

细胞凋亡发生异常，影响着肿瘤的生长转移。已有研究证实在肿瘤中检测细胞凋亡相关基因的表达可成为肿瘤诊断和判断预后的有效手段[12]。其中Bcl-2家族是被研究得最多的一类细胞凋亡相关基因。Bax是Bcl-2家族中促凋亡基因，当细胞内Bcl-2表达过多，与Bax形成二聚体，使胶质瘤细胞凋亡趋势减弱，打破了细胞增殖与凋亡的平衡，使细胞数目不断增加，从而表现出生长优势，是NSCLC肿瘤转移形成的重要基础。Sun等[13]和刘瑞芳等[14]发现Bax在NSCLC中的表达明显低于正常组织，并且与NSCLC的淋巴结转移，TNM分期相关。本实验亦发现Bax在NSCLC中表达明显低于正常组织，并与TNM分期，与淋巴结转移有关，从而说明Bax的表达与NSCLC的发生发展及淋巴结转移密切相关。而Caputi等[15]用免疫组织化学检测55例NSCLC组织，发现72.7%患者Bax高表达，且高表达的Bax与TNM、病理类型和肿瘤分级之间没有关系。与本实验结果不一致的原因有可能是实验样本量太小造成误差，病例的选择，实验方法等不同有关。本研究也发现在NSCLC中，Bax在腺癌、鳞癌中的表达无差异。这些结果充分证实了Bax对NSCLC发生发展起负调控，由于Bax表达降低，肿瘤细胞凋亡作用减弱，侵袭作用加强，促进淋巴转移。

进一步通过Pearson相关性分析发现，NSCLC组织中VEGF和Bax表达负相关，且已有报道在乳腺癌细胞MCF-7中，通过siRNA干扰VEGF的表达，可显著降低Bcl-2/Bax比例，并诱导癌细胞凋亡[16]，提示通过干扰VEGF表达，提高Bax表达，能促进肿瘤细胞凋亡，避免癌细胞转移风险。

总之，VEGF的表达在NSCLC发生、发展中起着促进作用，Bax的表达在NSCLC发生发展中起着抑制作用，二者的表达呈负相关，可为NSCLC的诊断及预后提供判断依据。

参考文献

[1]Siegel R,Ma JM,Zou ZH,et al.Cancer statistics,2014[J].CA Cancer J Clin,2014,64(1):9-29.

[2]Zhong W,Yang X,Bai J,et al.Complete mediastinal lymphadenectomy:the core component of the multidisciplinary therapy in resectable non-small cell lung cancer[J].Eur J Cardiothorac Surg,2008,34(1):187-195.

[3]Donnem T,Al-Shibli K,Al-Saad S,et al.VEGF-A and VEGFR-3 correlate with nodal status in operable non-small cell lung cancer:inverse correlation between expression in tumor and stromal cells[J].Lung Cancer,2009,63(2):277-283.

[4]吴海珍，刘东华．VEGF与非小细胞性肺癌关系的研究进展[J]．临床肺科杂志，2014，19(3)：513-515．

[5]Hu Y,Hu MM,Shi GL,et al.Imbalance between vascular endothelial growth factor and endostatin correlates with the prognosis of operable non-small cell lung cancer[J].Eur J Surg Oncol,2014,40(9):1136-1142.

[6]Brussino L,Culla B,Bucca C,et al.Inflammatory cytokines and VEGF measured in exhaled breath condensate are correlated with tumor mass in non-small cell lung cancer[J].J Breath Res,2014,8(2):027110.

[7]Liu X,Zhang H,Yu X,et al.The correlation of expression of VEGF and EGFR with SUV of (18)FDG-PET-CT in non-small cell lung cancer[J].Contemp Oncol (Pozn),2014,18(5):334-339.

[8]刘东华．非小细胞肺癌VEGF-C的表达及LYVE-1标记的微血管密度与淋巴结转移的关系[J]．中国老年学杂志，2012，32(18)：3927-3928．

[9]Hao S,Yang Y,Liu Y,et al.JAM-C promotes lymphangiogenesis and nodal metastasis in non-small cell lung cancer[J].Tumour Biol,2014,35(6):5675-5687.

[10]Xin X,Majumder M,Girish GV,et al.Targeting COX-2 and EP4 to control tumor growth,angiogenesis,lymphangiogenesis and metastasis to the lungs and lymph nodes in a breast cancer model[J].Lab Invest,2012,92(8):1115-1128.

[11]Feng Y,Hu J,Ma J,et al.RNAi-mediated silencing of VEGF-C inhibits non-small cell lung cancer progression by simultaneously down-regulating the CXCR4,CCR7,VEGFR-2 and VEGFR-3-dependent axes-induced ERK,p38 and AKT signalling pathways[J].Eur J Cancer,2011,47(15):2353-2363.

[12]Yigit S,Demir L,Tarhan MO,et al.The clinicopathological significance of Bax and Bcl-2 protein expression with tumor infiltrating lymphocytes in ovarian carcinoma[J].Neoplasma,2012,59(5):475-485.

[13]Sun Q,Hua J,Wang Q,et al.Expressions of GRP78 and Bax associate with differentiation,metastasis,and apoptosis in non-small cell lung cancer[J].Mol Biol Rep,2012,39(6):6753-6761.

[14]刘瑞芬，蒋军广，张晓燕，等．凋亡相关基因bax在非小细胞肺癌中的表达及临床意义[J]．中国老年学杂志，2013，33(9)：2002-2003．

[15]Caputi M,Groeger AM,Esposito V,et al.Frequent high expression of bax pro-apoptotic protein in non-small cell lung cancer[J].Anticancer Res,1999,19(1B):825-827.

[16]Ge YL,Zhang X,Zhang JY,et al.The mechanisms on apoptosis by inhibiting VEGF expression in human breast cancer cells[J].Int Immunopharmacol,2009,9(4):389-395.

Expression and significance of VEGF and Bax in non-small cell lung cancer

CaoWenrong,YanWenxiu,WangXueli

(DepartmentofPathological，EighthPeople′sHospitalofQingdaoCity，Qingdao,Shandong,266100,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) and Bax in non-small cell lung cancer (NSCLC) and clinical value.MethodsParaffin specimens were collected from 80 cases of NSCLC tissues(NSCLC group) and 20 cases of normal lung tissue adjacent to benign lesions(control group).Western blot and immunohistochemistry were used to dectect the expression of VEGF and Bax.The relationship of the expression of VEGF and Bax with histological classification,stage,lymph mode metastasis were analyzed.ResultsThe expression of VEGF in NSCLC group was higher than that in control group,the differences were statistically significant (P<0.05).The higher expression of VEGF in the group of stage Ⅲ-Ⅳ was obtained than that in the group of stage Ⅰ-Ⅱ (P<0.05).The higher expression of VEGF in the group with lymph mode metastasis was obtained than that in the group without lymph mode metastasis (P<0.05).The expression of VEGF was not found to be related with histological classification (P>0.05).The expression of Bax in NSCLC tissue was lower than that in normal tissue,the differences was statistically significant (P<0.05).The lower expression of Bax in the group of stage Ⅲ-Ⅳ was obtained than that in the group of stage Ⅰ-Ⅱ (P<0.05).The lower expression of Bax in the group with lymph mode metastasis was obtained than that in the group without lymph mode metastasis (P<0.05).The expression of Bax was not found to be related with histological classification (P>0.05).The expression of VEGF was negatively correlated with Bax in NSCLC (P<0.05).ConclusionThe expression of VEGF played a promoting effect in the NSCLC,and was negatively correlated with the expression of Bax protein,and the expression of the two could provide a basis for the diagnosis and prognosis of NSCLC.

[Key words]carcinoma,non-small-cell lung;lymphatic metastasis;vascular endothelial growth factor A;bcl-2-associated X protein

作者简介：曹文荣(1971-)，主治医师，本科，主要从事病理科工作及研究。

doi:·论著·10.3969/j.issn.1671-8348.2016.03.006

[中图分类号]R734.2

[文献标识码]A

[文章编号]1671-8348(2016)03-0307-03

(收稿日期：2015-08-08修回日期：2015-10-16)