人血清白蛋白微/纳米管的制备及影响因素

焦培培，郭艳丽，牛爱华，亢晓峰

西北大学合成与天然功能分子化学教育部重点实验室，西北大学化学与材料科学学院，陕西 西安 710127

人血清白蛋白微/纳米管的制备及影响因素

焦培培，郭艳丽*，牛爱华，亢晓峰*

西北大学合成与天然功能分子化学教育部重点实验室，西北大学化学与材料科学学院，陕西 西安 710127

以聚碳酸酯(polycarbonate，PC)为模板，聚乙烯亚胺(polyethyleneimine，PEI)为连接剂，采用静电层层自组装技术制备了人血清白蛋白(human serum albumin，HSA)微米管和纳米管，讨论了溶液pH、离子强度、组装层数、沉淀清洗次数和模板孔径对组装效果的影响。利用扫描电子显微镜(SEM)、透射电子显微镜(TEM)、傅里叶变换红外光谱仪(FTIR)和X射线能谱仪(EDS)对蛋白质微/纳米管的结构和组成进行了表征。结果表明，溶液pH和离子强度是影响组装效果的关键因素，在HSA和PEI溶液pH分别为7.4和10.3，且PEI溶液不含NaCl的条件下组装得到的微/纳米管具有良好的中空开口管状结构；微/纳米管的外径由模板孔径决定；调节组装层数可控制管壁厚度，且组装层数越多，管壁越厚，由此可实现对微/纳米管内径大小的调控；为保证管状结构的完整性，避免较薄的管壁在模板溶解和真空干燥过程中造成破坏，PEI/HSA双分子层数应不少于3；采用极性胺基溶剂N，N-二甲基甲酰胺(N，N-Dimethylformamide, DMF)可较好地溶解PC模板从而释放管状物。

蛋白质微/纳米管；层层自组装；模板

引 言

蛋白质纳米管是以蛋白质为主要材质的纳米材料。与蛋白质修饰的无机纳米管如碳纳米管[1]、二氧化硅纳米管[2]和磁性纳米管[3]相比，蛋白质纳米管具有良好的生物活性、生物相容性、易于降解、易于改性和修饰等特点，在生物分离[4-5]、生物催化[6-7]和药物传递[8]等领域有着独特优势。目前制备方法主要是将纳米多孔模板与层层自组装技术相结合，制得的管状物外径在200 ～800 nm之间[9]，而外径在微米级的蛋白质微米管还未见文献报道。微米管通常比纳米管具有更好的力学性能和单分散性，可借助于目前的微米操作技术对其进行单个操作。蛋白质微米管在生物组织的穿刺、细胞的提取、分离和生物芯片输运等方面有着潜在的应用前景[10]。

人血清白蛋白(HSA，pI=4.7)是人体血浆中含量最为丰富的蛋白质，具有运输内源物质和外源物质的作用和维持细胞外pH、渗透压的功能。由于水溶性好、稳定性强、制备产量大和纯度高，它是理想的蛋白质模型分子。聚乙烯亚胺是一种聚阳离子电解质，在静电层层自组装中常被用作分子层间的连接剂[11]。在蛋白质纳米管制备技术基础上，对组装条件如溶液pH、离子强度、组装层数、沉淀清洗次数和模板孔径进行详细讨论和优化，制得具有良好管状结构的PEI/HSA微米管和纳米管，并利用SEM，TEM，FTIR和EDS对产物形态和组成进行表征。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

ZetaPALS型Zeta电位与粒径分析仪(BIC公司，美国)；E1010型离子溅射仪(Hitachi公司，日本)；JSM-6390A型扫描电子显微镜(JEOL公司，日本)；H-600投射式电子显微镜(Hitachi公司，日本)；LSP02-1B型注射泵(保定兰格恒流泵有限公司)；FD-1C-50型冷冻干燥机(北京博医康实验仪器有限公司)；聚乙烯亚胺PEI(Mw=750 000，50%(w/vin water)，Sigma公司)；人血清白蛋白HSA(96%～99%，sigma公司)；聚碳酸酯膜PC(周长25 mm，孔径0.4和3 μm，Whatman公司)；N,N-二甲基甲酰胺DMF(分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司)；PB缓冲溶液(10 mmol·L-1，pH 7.4)；实验用水均为18.2 MΩ·cm-1的超纯水。

1.2 人血清白蛋白微/纳米管的制备

采用层层自组装技术制备PEI/HSA微/纳米管[5]，并做了部分修改。首先将PC膜放置在过滤头内固定好。利用注射泵将12 mL 1 mg·mL-1PEI溶液以0.25 mL·min-1的速度流过PC膜，然后用12 mL 超纯水以1 mL·min-1的流速冲洗，氮气吹干；再将12 mL 2 mg·mL-1的HSA溶液以0.5 mL·min-1的速度流过已组装PEI层的PC膜，用12 mL 超纯水以1 mL·min-1的流速冲洗，氮气吹干。每完成一层组装，用蘸湿的棉签轻轻擦拭膜表面以除去吸附的PEI和HSA。根据需要选择重复组装PEI和HSA的次数。将组装好的PC膜真空干燥12 h(0.09 MPa)后，浸入DMF以除去模板，所得沉淀物用DMF清洗，冷冻干燥(-60 ℃，<20 Pa)后得到粉末状固体。

1.3 PEI/HSA微/纳米管的表征

用3%磷钨酸对样品分散液负染后进行TEM分析；冷冻干燥样品用离子溅射仪镀金膜后用于SEM和EDS分析；使用KBr压片进行FTIR分析(其中PEI预先真空干燥24 h)。

2 结果与讨论

2.1 组装溶液pH的选择

PEI/HSA微/纳米管的制备是利用静电层层自组装技术将带正电的PEI和带负电的HSA依次交替沉积至PC膜的微/纳米孔洞内壁。在此过程中，带负电的HSA吸附至已组装显正电的PEI层，使得形成的PEI/HSA复合膜电性反转而带负电，从而利于后续正电PEI的吸附，因此要求PEI和HSA电量相互匹配。Dobrynin等[12]对纳米孔洞内的LbL组装进行了计算机动态模拟，认为对于聚电解质-纳米颗粒(N-P)体系，过电荷分数约为0.5，即被吸附物一半的电荷用于中和上一层膜的过电荷，另一半则用于形成新组装膜的过电荷，这对于实验选择电荷量匹配的聚电解质起到了借鉴作用。

实验中，HSA和PEI的电荷量可用zeta电位表示。如图1(a)所示，HSA的zeta电位受溶液pH影响，当溶液pH<4.7时，HSA分子带正电；当溶液pH>4.7时，HSA分子带负电。实验中选择HSA溶液的pH为7.4，此时zeta电位为(-15.0±2.8) mV。

弱聚电解质PEI的离子化程度可通过溶液pH调节[13]。如图1(b)所示，在pH<11时其分子带正电，随着pH减小，PEI链上的胺基基团质子化程度增加，zeta电位增大；当质子化完全时(pH～8)，随着pH继续减小，引起溶液的离子强度增大，导致相邻带电基团间的屏蔽作用增强，测得的zeta电位值反而减小。为与HSA的电荷量相匹配，实验中选择PEI的zeta电位为(17.6±3.3)mV，溶液pH为10.3。

2.2 离子强度的影响

弱聚电解质构型受溶液pH和离子强度的影响，从而影响其在模板的吸附情况。当溶液中不含NaCl时，PEI的离子化程度仅由pH控制，此时，由于链上相邻带电基团的排斥作用，呈伸展链状构型；当溶液离子强度增加，电荷屏蔽作用增强，相邻带电基团间的静电排斥作用减弱，呈紧密线团构型[13]。实验中发现，PEI溶液中不含NaCl时的组装效果好于加入时的组装效果，推测可能是由于呈伸展链状的枝状(branched)PEI能更有效地连接球状HSA分子。

Fig.1 pH dependent zeta potential of 2 mg·mL-1HSA (a) and 1 mg·mL-1 PEI (b)

2.3 组装层数的影响

图2为不同组装层数HSA微米管的SEM图。可以看到(PEI/HSA)3微米管的管壁较薄、表面粗糙且管状结构不完整[图2(a)]。相比较而言，(PEI/HSA)5PEI微米管的管壁较厚、表面光滑且管状结构完整[图2(b)]。因此，通过改变组装层数可以控制管壁的厚度，且随着组装层数增加，壁厚增加。为保证管状结构的完整性，避免较薄的管壁在模板溶解和真空干燥条件下造成破坏，PEI/HSA双分子层数应不少于3。

2.4 沉淀清洗次数的影响

在微/纳米管的制备过程中，组装好的(PEI/HSA)5PEI聚电解质多层膜最初以吸附在PC膜微/纳米孔洞内壁的形式存在，因此选择合适的手段除去模板释放(PEI/HSA)5PEI十分重要。实验中利用极性胺基溶剂DMF溶解PC模板。如图3所示，DMF清洗沉淀物的次数影响管状物的释放效果。当清洗3次时，(PEI/HSA)5PEI仍嵌入在PC模板并未完全释放[(图3(a)]；当增至5次，(PEI/HSA)5PEI已基本释放完全[图3(b)]。因此，DMF清洗沉淀的次数应在5次以上。

Fig.2 SEM images of (PEI/HSA)3micronotubes (a) and (PEI/HSA)5PEI microtubes (b) prepared by depositing PEI and HSA for 3 and 5.5 cycles into 3 μm PC template, respectively)

Fig.3 SEM images of partially released (a) and fully released (b)(PEI/HSA)5PEI microtubes (PC template pore diameter, 3 μm)

2.5 模板孔径的影响

图4所示为(PEI/HSA)5PEI微米管和纳米管的SEM图，均可以看到结构良好的中空管状结构。测得微米管[图4(a)]的外径和管长分别为(3.08±0.15)和(8.48±0.83)μm，与3 μm PC模板的孔径(3.02±0.44)μm和厚度(6～11 μm)相符；纳米管[图4(b)]的外径、内径和壁厚分别为(455±13), (234±10)和(151±7)nm，其中外径与400 nm PC模板的孔径(458±18)nm相吻合。(PEI/HSA)5PEI的管壁可被认为是由11个分子层组成的空心圆柱模型，其中HSA层为单个HSA分子的厚度。根据单晶结构[14]和小角度X射线衍射[15]分析得到的HSA分子大小为8.0 nm。由纳米管的壁厚和HSA的大小可计算得到PEI层的厚度为18.5 nm，该值与纳米多孔模板内LbL组装的聚电解质膜的厚度相吻合[5]。

Fig.4 SEM images of (PEI/HSA)5PEI microtubes (a) and (PEI/HSA)5PEI nanotubes (b) prepared by using PC template with 3 μm and 400 nm pore diameter, respectively

2.6 TEM，FTIR和EDS表征结果

图5(a)所示为(PEI/HSA)5PEI纳米管的TEM图，可以看到单个的管状结构，测得管长约(5.6±0.9)μm，和PC模板的厚度6 μm相近。

元素分析结果进一步说明了纳米管的成分。如图5(c)所示，构成(PEI/HSA)5PEI纳米管的主要元素有C，N，O和S，说明HSA和PEI被组装在纳米管管壁。

3 结 论

利用模板与层层自组装技术相结合成功地制备了人血清白蛋白微米管和纳米管，讨论了溶液pH、离子强度、组装层数、沉淀清洗次数和模板孔径对管状结构的影响，并通过SEM，TEM，FTIR和EDS手段表征了其形态和组成。结果表明，在HSA和PEI溶液pH分别为7.4和10.3，且PEI溶液不含NaCl的条件下组装得到的微/纳米管具有良好的管状结构；调节组装层数可控制管壁厚度，且组装层数越多，管壁越厚，由此可实现对微/纳米管内径大小的调控；模板孔径决定了微/纳米管的外径。

Fig.5 (a) TEM image of (PEI/HSA)5PEI nanotube (PC template pore diameter, 400 nm) (b) FTIR spectra of (PEI/HSA)5PEI nanotubes, PEI and HSA (c) EDS spectra of (PEI/HSA)5PEI nanotubes. The inset is the elemental percentage

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*Corresponding authors

Preparation of Human Serum Albumin Micro/Nanotubes

JIAO Pei-pei, GUO Yan-li*, NIU Ai-hua, KANG Xiao-feng*

Key Laboratory of Synthetic and Natural Functional Molecular Chemistry, College of Chemistry & Materials Science, Northwest University, Xi’an 710127，China

In this research, protein micro/nanotubes were fabricated by alternate layer-by-layer (LbL) assembly of human serum albumin (HSA) and polyethyleneimine (PEI) into polycarbonate (PC) membranes. The experimental conditions of pH values, ionic strength, the depositions cycles and the diameter of porous membrane were discussed. The morphology and composition of tubes were characterized by scanning electron microscope (SEM), transmission electron microscope (TEM), fourier transform infrared spectroscopy (FTIR) and energy dispersive spectroscopy (EDS). The results show that pH and ionic strength of the solution are the key factors that influence the effect of assembly. Micro/nanotubes with good opening hollow tubular structure were obtained when pH 7.4 HSA solution and pH 10.3 PEI solution without NaCl were used in synthesis procedure. The outer diameter of tube was dependent on the PC template, thus the micro/nanotubes size was controlled by the wall thickness, which can be adjusted by the number of layers of the HSA and PEI deposited along the pore walls. To avoid the thin wall being damaged in dissolving the template and vacuum drying, the PEI/HSA bilayer number should not be less than 3. The polar solvent N,N-dimethylformamide (DMF) can dissolve PC template to release the micro/nanotubes.

Protein micro/nanotubes; Layer-by-layer assembly; Template

Mar. 22, 2015; accepted Jul. 16, 2015)

2015-03-22，

2015-07-16

国家自然科学基金项目(21175105, 21375104，21327806)，陕西省自然科学基金项目(2014JM2050)，陕西省教育厅专项基金项目(12JK0634)和高等学校博士学科点专项科研基金(20126101110015)资助

焦培培，女，1989年生，西北大学化学与材料科学学院硕士研究生 e-mail：jppme23@163.com *通讯联系人 e-mail：guoyl@nwu.edu.cn; kangxf@nwu.edu.cn

O657.3

A

10.3964/j.issn.1000-0593(2016)01-0191-05