基于多光谱成像技术的宫颈脱落细胞DNA定量分析研究

吴 正，曾立波，吴琼水

武汉大学电子信息学院，湖北 武汉 430079

基于多光谱成像技术的宫颈脱落细胞DNA定量分析研究

吴 正，曾立波*，吴琼水*

武汉大学电子信息学院，湖北 武汉 430079

常用的宫颈癌筛查方法有TBS(the bethesda system)分类法和细胞DNA定量分析法两种，而同时利用多重染色方法在同一张细胞涂片上对细胞质进行巴氏染色和对细胞核进行Feulgen染色进行宫颈癌筛查的研究仍然是空白。多重染色筛查方法的难点在于非DNA物质的吸光度会干扰DNA物质的吸光度。因此建立了一套多光谱成像系统，并基于吸光度的线性叠加特性，利用多元线性回归方法建立了吸光度剥离模型，通过该模型成功地将DNA物质的吸光度剥离出来进行DNA定量分析，实现了两种常用方法的完美结合。通过一系列实验证明了，利用模型剥离出的DNA物质的吸光度与实测的DNA物质的吸光度在检验水平为1%的情况下在统计学上没有显著差异，而且实际应用测试中的统计数据也显示在置信水平为99%的情况下使用该分析方法筛查得到的四倍体细胞的DNA指数的置信区间与癌细胞的DNA指数判别区间没有交集，验证了这种基于多光谱成像技术的多重染色的DNA定量分析方法的准确性和可行性，在宫颈癌乃至其他癌症的早期诊断和筛查中有巨大的市场应用潜力与广阔的应用前景。

DNA定量分析； 多光谱成像技术； 多光谱剥离模型； 多元线性回归

引 言

宫颈癌是妇科高发的恶性肿瘤之一，对宫颈癌及癌变的早期诊断是提高宫颈癌治愈率及生存率的关键。目前常用的防癌筛查方法是TBS分类法和细胞DNA定量分析诊断方法[1-2]。许多研究表明，细胞DNA定量分析诊断方法在早期诊断方面具有更大优势[3-5]。

目前这两种方法是分别在不同的涂片上进行筛查，于是就会出现以下情况： 医生如果对TBS分类法筛查出的结果不确定，为了提高准确性就需要使用DNA定量分析系统进行确认； 而通过DNA定量分析系统找出的异常细胞，医生又无法通过细胞形态来进行TBS分类，需要医生在另外一张涂片上进行TBS分类。

两种筛查方法各自独立分析，并没有在同一张细胞涂片上同时进行分析，因此我们提出了一种在同一张细胞涂片上能够同时使用以上两种肿瘤筛查方法的解决方案。这种方法只需要一次取材，一次制片，对细胞核使用Feulgen染色，对细胞质使用巴氏染色，这样在既可以通过Feulgen染色后的DNA进行定量分析来筛查癌变细胞，同时染色的细胞质可以进行细胞学形态分析。以DNA定量分析技术为主，细胞形态学分析为辅，可实现优势互补，显著提高诊断准确率。该方法能完美实现DNA定量分析方法和传统细胞学检查的结合，大大减轻医生的工作量。

虽然这种分析方法能够在同一张涂片上实现两种分析方法的结合，但是这种多重染色方法也带来了一个难题，即吸光度干扰的问题。传统的DNA定量分析系统只使用一个特定波段的单色光，而且染色物质只有DNA一种。而复染方式中含有的染色物质不止DNA一种，那些其他物质在该特定的光谱波段的上也有吸收。因此，建立了多光谱成像系统，通过采集各吸光物质的多光谱图像，得到了各物质的吸光度特征参数，以此建立了多光谱成像系统的吸光度剥离模型，成功地从总吸光度中剥离出了DNA物质的吸光度，提高了DNA定量分析的准确度。

1 原 理

1.1 细胞DNA含量定量分析原理

细胞DNA定量分析主要是通过细胞核内DNA含量或者染色体倍数的测定来判断细胞的生理状态和病理改变。Feulgen DNA染色是一种能专一显示脱氧核糖核酸的染色方法，细胞核染色后的颜色深浅与DNA含量有关。根据Lambert-Beer定律，吸光度正比于物质的含量，物质的含量越多，吸收光越多，光的透射越低。令入射光束强度为I0，正常细胞的组织涂片的透射光束强度为In，正常细胞的DNA的量浓度为cn，正常细胞的DNA的吸光度为An，待测细胞涂片的透射光束强度为Id，待测细胞的DNA的量浓度为cd，待测细胞的DNA的吸光度为Ad，对于相同的测试系统有相同的入射光束强度I0和相同的光程b，而相同的检测物质有相同的摩尔吸光系数ε，那么根据Lambert-Beer定律有

(1)

将式(1)中等式进行相除可得

(2)

式中，DI表示DNA指数，也是表征癌变程度的医学参数，正常细胞的DI大约等于1，处于增殖分裂的细胞的DI大约等于2，异常的癌变细胞的DI远大于2。

1.2 多光谱成像系统构成和剥离模型原理与建立

1.2.1 硬件系统构成

图1所示为基于液晶可调谐滤光片(liquid crystal tunable filter，LCTF)的多光谱成像系统结构示意图。该系统主要由LCTF、显微光学系统和成像CCD相机三部分构成。

Fig.1 Schematic diagram of multispectral imaging system

其中LCTF是根据液晶的电控双折射效应和偏振光的干涉原理制成的新型光器件，作为滤光片，它具有带宽窄、功耗低、调谐范围宽、驱动电压低、结构简单、无移动部件等优点，在多光谱成像领域的应用广泛[6-7]。本实验的分光器件LCTF，选用美国CRI公司的VariSpecTM(VIS-07-35-STD)，工作光谱范围为400～720 nm，半峰全宽为10 nm，工作孔径为20 nm，透射率曲线如图2(a)所示。CCD相机选用德国VDS公司的vosskuhier系列的COOL-1300Q型单色面阵冷却CCD相机。该相机的分辨率为1 280×1 024，像素大小为2/3英寸，噪声低，在400～700 nm范围内有比较高的光谱响应度，如图2(b)。显微光学系统选用日本Olympus BX41显微镜，该显微镜使用先进的UIS2光学系统，能够在整个视场获得平坦、均匀、高对比度的图像，而且可以轻松连接数字成像装置。

Fig.2 Component performance of the imaging system

1.2.2 成像系统的光路中的传递函数

R(λk)=A(λk)ω(λk)+n(λk)

(3)

式中，n(λk)表示中心波长为λk时的噪声。当光源关闭时，可认为暗背底响应R(λk0)=n(λk)。当光源打开时，式(3)可近似为理想情况，即

R(λk)-R(λk0)=A(λk)ω(λk)

(4)

当载玻片为空白玻片时，可认为此时的I(λk)=A0(λk)，则根据式(4)有

(5)

式中，R0(λk)表示空白背景的CCD相机的响应值，Rd(λk)表示载玻片上有被测物质时的CCD相机的响应值，则被测物质的吸光度A可表示为

(6)

Fig.3 The transfer functions in the optical path of the multispectral imaging system

1.3 工作流程

该多光谱成像系统的工作流程是：

(1)获取暗背底的多光谱图像： 关闭光源，将LCTF的中心波长以10 nm为间距从490 nm调谐到680 nm，在每个波段下，通过CCD采集一幅图像，共计20帧图像。暗背底图像中包含的是CCD图像传感器的暗电流噪声以及环境散射光在CCD图像传感器上的响应等。式(4)中的R(λk0)表示暗背底在CCD上的响应。

(2)获取空白背景的多光谱图像： 显微镜载物台上放置没有细胞组织涂片的载玻片，打开光源并调整到合适的强度，以上述同样的方式获取一组多光谱图像。式(5)中的R0(λk)表示空白背底在CCD上的响应。

(3)获取样品的多光谱图像： 载玻片更换为含有染色细胞的涂片，以同样的方式调谐LCTF，获取一组多光谱图像。式(5)中的Rd(λk)表示样品在CCD上的响应。

获取以上三组多光谱图像数据后，就可以根据式(6)计算每个像素点的吸光度。

1.4 多光谱图像的吸光度剥离原理及模型建立

根据吸光度的加和性可知，某一波长的单色光，在通过吸收介质时，如果吸收介质中同时含有n种吸光物质，只要这些吸光物质的各组分没有直接相互作用，则吸收介质对光的总吸光度A等于介质中各组分吸光度Ai之和

(7)

若有m个波段的单色光，中心波长分别为λ1，λ2，…，λm，则式(7)可扩充为

(8)

A=T×c

(9)

根据多元线性回归方法求得式(9)中向量c的最小二乘解为

c=(TT×T)-1×TT×A

(10)

式中，(TT×T)-1为n阶方阵TT×T的逆矩阵。

在多重染色方法中，主要有三种染色吸光物质： 伊红物质、DNA和亮绿物质，即n=3。采用相对测量策略的方式，选取分别使用三种染色方法单独进行染色正常细胞的组织涂片，令： 纯Feulgen染色法染色的涂片中，各物质的浓度向量c=[0 0 1]T，纯亮绿染液染色的涂片中各物质的浓度向量为[0 1 0]T，纯伊红染液染色的涂片中各物质的浓度向量为[1 0 0]T。

(11)

使用同样的方法确定特征矩阵的另外2组m个参数，不同的是载玻片中分别只含有亮绿物质和伊红物质。多光谱图像是由20个波段的图像组成，从490～680 nm，以10 nm为间隔，即m=20，根据式(11)测量的以上三种染色物质的吸光度曲线如图4所示，图中曲线A表示伊红物质，曲线B表示DNA，曲线C表示亮绿物质，每种物质的吸光度都进行了归一化处理。三种物质都有明显的吸光度峰值区域，且相互交叉不严重，有利于吸光度剥离模型的建立。

Fig.4 The absorbance curves of three kinds of materials

在获取了特征矩阵T的总共3×20个参数后，就可以计算出得到了矩阵TT×T的逆矩阵(TT×T)〗-1。根据式(11)就可以根据通过多光谱成像系统获得的吸光度向量A，计算出成像在CCD相机上各像素点的对应区域的各待测物质的浓度向量c。将计算出的浓度向量c代入到式(8)中的中心波长为580 nm时的等式中，有

(12)

2 结果与讨论

多光谱成像系统的成像波段数为20个，从490～680 nm，以10 nm为间隔。虽然多光谱成像系统中的LCTF的工作波段是400～720 nm，但是从实际获取的图像上，我们观察到400～480 nm共计9个波段上的图像噪声大，成像质量不佳，因此排除； 而且实际采用的20个波段的图像数据也已经足够用于剥离模型的建立。

本方法的实验验证方法主要有以下三个：

(2)目测比较。将通过模型计算出的DNA物质的吸光度矩阵还原成灰度图像进行目测，并与其他图像进行比较，观察是否将细胞核部分完全剥离出来，是否将细胞质中吸光物质的吸光度消除。

(3)实际应用测试。利用同一张细胞涂片分别使用本方法和单波段的DNA定量分析系统单独进行分析，比较测试结果。

H0：μD=0，H1：μD≠0

Table 1 Test results of image of cell tissue only stained with Feulgen reagent

实验2的目测比较结果，如图5所示，其中图5(a)是分别以中心波长为530，580和680 nm时获取的原始图像为B，G和R合成的伪彩色图像，图5(b)是以计算出的DNA的浓度乘以其在580 nm时的特征参数得到吸光度后，根据此时的背景的灰度值还原后的图像。从图像中我们可以明显的观察到剥离后的图像中很“干净”，即非细胞核部分的吸光度基本上都被剥离了，因此这些区域的灰度值非常接近背景的灰度值。剥离后的只含DNA的图像非常适合于进行DNA定量分析。而且合成的伪彩色图像中，细胞质的轮廓都很清晰，也便于医生进行TBS分类分析。

实验3的实际应用测试结果，图6所示，其中图6(a)为使用单波段的DNA定量分析系统计算出的DNA指数散点图和统计数据，图6(b)是利用多光谱成像技术和吸光度剥离模型计算出的吸光度计算出的DNA指数散点图和统计数据。从散点图上看，使用本方法的散点图要比单波段分析的要宽一些； 从统计数据上来看，使用单波段DNA定量分析系统检出的二倍体细胞数量百分比为99.917%，DI的平均值为1.011，标准差为0.069，标准差率为6.8%，而四倍体的数量百分比为0.028%，DI的平均值为2.068，标准差为0.118，标准差率为5.7%； 使用本方法检出的二倍体数量百分比为98.550%，DI的平均值为1.026，标准差为0.075，标准差率为7.3%，而四倍体的数量百分比为0.037%，DI的平均值为2.001，标准差为0.132，标准差率为6.6%。

Fig.5 The pseudo-color image (a) and the image obtained by the absorbance unmixing model process (b)

Fig.6 Comprison of the result of two different methods

查表得到t0.005(3)=5.840 9，则置信水平为(1-α)=0.99的置信区域为[1.616 2.386], 因此在置信水平为0.99的情况下，DI均值最大可能也只是2.386小于2.5的判断标准，不会出现误判的情况。

通过比较以上数据可以得出以下结论： 虽然使用本方法的分析结果的离散程度比使用单通道DNA定量分析的要稍微大一点，这是由于后者只使用了一个光谱波段的原因，误差源更少，精度更高，但是本方法在筛选癌细胞方面仍然是符合要求的。

3 结 论

通过在同一张涂片上使用多重染色方法，即对细胞核使用Feulgen染色和对细胞质使用巴氏染色，通过建立多光谱成像系统和多光谱吸光度剥离模型，成功将DNA物质的吸光度剥离出来进行DNA定量分析，实现了在同一张涂片上DNA定量分析和TBS分类分析的完美结合。实验数据和测试结果证明了这种方法的准确性和可行性，这种分析方法不仅可以通过细胞的形态来进行细胞形态学分析，还可以进行DNA定量分析，两种分析方式同时结合在一张涂片上，极大的提高了宫颈癌癌变的诊断率。而且该分析方法不仅是在宫颈癌的早期诊断中有重大意义，在其他类型癌症的的诊断中也有广阔的应用前景。

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*Corresponding authors

Study of Cervical Exfoliated Cell’s DNA Quantitative Analysis Based on Multi-Spectral Imaging Technology

WU Zheng，ZENG Li-bo*，WU Qiong-shui*

School of Electronic Information，Wuhan University，Wuhan 430079，China

The conventional cervical cancer screening methods mainly include TBS (the bethesda system) classification method and cellular DNA quantitative analysis, however, by using multiple staining method in one cell slide, which is staining the cytoplasm with Papanicolaou reagent and the nucleus with Feulgen reagent, the study of achieving both two methods in the cervical cancer screening at the same time is still blank. Because the difficulty of this multiple staining method is that the absorbance of the non-DNA material may interfere with the absorbance of DNA, so that this paper has set up a multi-spectral imaging system, and established an absorbance unmixing model by using multiple linear regression method based on absorbance’s linear superposition character, and successfully stripped out the absorbance of DNA to run the DNA quantitative analysis, and achieved the perfect combination of those two kinds of conventional screening method. Through a series of experiment we have proved that between the absorbance of DNA which is calculated by the absorbance unmixxing model and the absorbance of DNA which is measured there is no significant difference in statistics when the test level is 1%, also the result of actual application has shown that there is no intersection between the confidence interval of the DNA index of the tetraploid cells which are screened by using this paper’s analysis method when the confidence level is 99% and the DNA index’s judging interval of cancer cells, so that the accuracy and feasibility of the quantitative DNA analysis with multiple staining method expounded by this paper have been verified, therefore this analytical method has a broad application prospect and considerable market potential in early diagnosis of cervical cancer and other cancers.

DNA quantitative analysis; Multi-spectral imaging; Multi-spectral unmixing model; Multiple linear regression

Feb. 2, 2015; accepted Jun. 15, 2015)

2015-02-02，

2015-06-15

国家科技支撑计划课题(2011BAF02B02)资助

吴 正，1987年生，武汉大学电子信息学院博士研究生 e-mail: wuzheng@whu.edu.cn *通讯联系人 e-mail: lbzeng@whu.edu.cn； qswu@whu.edu.cn

TP391

A

10.3964/j.issn.1000-0593(2016)02-0496-06