红外光谱对三七及其野生近缘种亲缘关系研究

李 运， 王元忠， 杨维泽， 杨绍兵， 张金渝*， 徐福荣

1. 云南中医学院中药学院， 云南 昆明 650500

2. 云南省农业科学院药用植物研究所， 云南 昆明 650200

红外光谱对三七及其野生近缘种亲缘关系研究

李 运1, 2， 王元忠2， 杨维泽2， 杨绍兵2， 张金渝1, 2*， 徐福荣1*

1. 云南中医学院中药学院， 云南 昆明 650500

2. 云南省农业科学院药用植物研究所， 云南 昆明 650200

傅里叶变换红外光谱； 三七； 野生近缘种； 亲缘关系； 种质资源

引 言

三七Panaxnotoginseng(Burkill) F. H. Chen ex C. Chow & W. G. Huang为五加科(Araliaceae)人参属(Panax)植物， 主要以根入药， 是我国特有名贵中药。 当今社会， 心脑血管类疾病成为人类健康的第一杀手， 越来越多的人受到心脑血管类疾病的困扰。 三七具有降血压、 保护神经、 抗血栓、 抗动脉粥样硬化等预防及治疗心血管类疾病的作用[1]， 这使得人们对其需求量大大增加。

三七在我国药用历史有600多年， 种植历史有400多年， 三七种植面积以及产量随需求逐年增加， 但是三七遗传多样性丧失[2]、 种质资源退化[3]使得三七在抗病性、 抗逆性方面变差， 直接导致了在三七种植过程中农药使用过度， 三七连作障碍严重化[4]等问题的出现。

野生近缘种(wild relative)是指与栽培植物具有近缘关系的野生物种[5]； 由于野生近缘种生存在自然环境下， 长期抵御各种生物和非生物胁迫， 在其进化过程中形成并积累了丰富的遗传变异和有益基因资源[6]。 这些因素在改善栽培物种品质与产量[7]、 丰富种质资源方面起到十分重要的作用。 三七野生近缘种具有较强抗逆性， 与三七相比屏边三七P.stipuleanatusC. T. Tsai & K. M. Feng几乎不染病， 且基本对三七病害免疫[8]。 因此， 对三七及其野生近缘种进行亲缘关系研究在改善三七品质和产量及丰富三七种质资源等方面具有重要意义。

在植物亲缘关系研究方面， 通过植株形态特征[9]、 AFLP技术[10]、 RAPD分子鉴定[11]等方法进行分类， 繁琐、 费时、 需要复杂设备和专业知识。 傅里叶变换红外光谱法(FTIR)是通过化合物分子振动吸收特定波长红外光， 得到化合物官能团、 化学键等信息的结构分析方法[12]。 能够反映化合物中丰富的化学成分信息， 具有快速简便、 无损、 灵敏度高等特点。 结合化学计量学方法， 红外光谱已经被应用于中药的产地鉴别[13]、 生长年限与真伪品鉴别[14-15]等多个方面。 此外， 该方法对生物进行分类研究以及亲缘关系研究具有十分成熟的理论基础与实践支持， 如竹类植物分类研究、 小麦属与山羊草属植物[16]、 微生物鉴别分类研究[17]等。

将FTIR用于三七及其3个近缘种的研究。 仅通过对比不同物种之间红外光谱进行亲缘关系研究， 主观性较强[18]。 而化学计量学能对数据进行更加客观地分析。 本研究使用FTIR结合主成分分析(principal component analysis, PCA)、 偏最小二乘判别分析(partial least squares discriminant analysis, PLS-DA)及系统聚类分析(hierarchical cluster analysis, HCA)， 对三七及其4个野生近缘种进行亲缘关系研究， 为三七的品种改良及种质资源开发利用提供理论基础。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Frontier型傅里叶变换红外光谱仪(配备DTGS检测器， 扫描范围为4 000～400 cm-1， 扫描信号累加16次， 分辨率为4 cm-1， 美国Perkin Elmer公司)； KBr(分析纯， 风船化学试剂科技有限公司)； 三七总皂苷标准品panax notoginsenosides(中国药品生物制品检定所， 编号f)； YP-2型压片机(山岳科学仪器有限公司)； FW-100型高速粉碎机(华鑫仪器厂)； 80目标准筛盘(道墟五四仪器厂)。

1.2 样品制备与检测

检测样品为三七及其4个野生近缘种的根； 样品经由云南省农业科学院药用植物研究所张金渝研究员鉴定， 详见表1。 样品在50 ℃恒温下烘干至恒重， 粉碎过80目筛。 取样品粉末、 三七总皂苷标准品与KBr充分混合研磨， 将研磨粉末加入模具压成均匀薄片。 同一样品扫描两次， 取平均光谱， 扫描时扣除CO2和H2O的干扰。

1.3 数据处理

原始光谱通过OMNIC8.0 进行平均光谱、 自动基线校正、 平滑、 纵坐标归一化等预处理以及二阶导数处理。 使用ORIGIN8.0软件作图， SIMCA-P+10.0软件进行PCA和PLS-DA， SPSS20.0软件进行HCA。

表1 三七及其野生近缘种样品信息

2 结果与讨论

2.1 三七及其野生近缘种红外光谱分析

2.2 三七及其野生近缘种二阶导数红外光谱分析

对红外光谱进行二阶导数处理， 可以提高谱图的分辨率， 指示叠合的隐蔽谱峰[20]。 三七及其野生近缘种红外光谱十分相似， 但是在指纹区1 800～500 cm-1存在一定差别； 通过二阶导数处理放大三七及其野生近缘种红外光谱的不同谱峰， 可以对不同谱图进行区分， 从而达到区分不同物种的目的。 对人参属样品的二阶导数光谱(图2)指纹区进行分析可以发现， 784 cm-1处三七、 珠子参、 越南人参无峰； 屏边三七峰强不明显； 羽叶三七具有较强峰。 1 385 cm-1珠子参无峰； 三七、 屏边三七、 越南人参峰强不明显； 羽叶三七有较强峰。 1 800～500 cm-1波段内， 不同物种吸收峰有较大差异， 利用这一特点， 结合化学计量学方法， 可以对三七及其野生近缘种进行亲缘关系研究。

2.3 主成分分析

主成分分析是一种将多个变量通过线性变换以选出较少重要变量， 从而达到数据降维效果的多元统计分析方法[21]。 这种无监督模式识别的检测， 能够对对象或者变量间的相似点进行聚合并以图表示[22]， 是从不相关中分离相关信息的探索性方法[23]。 将经过数据降维得到主成分信息作为新的综合指标并作图， 可以对数据进行直观分析。 对三七及其野生近缘种二阶导数红外光谱1 800～500 cm-1波段进行主成分分析， 前6个主成分累计贡献率达到81.5%， 可以代表样品红外光谱大部分信息。 图3为主成分PC1， PC2， PC3组成的三维图， 图中同一物种聚集在一起， 部分物种个体之间有混杂。

图1 (a): 三七及其野生近缘种平均红外光谱； (b): 三七与三七总皂苷标准品红外光谱

Fig.1 (a): Average infrared spectra ofP.notoginsengand its wild relatives; (b): Infrared spectra ofP.notoginsengand panax notoginsenosides

图2 三七及其野生近缘种二阶导数红外光谱

2.4 偏最小二乘判别分析

偏最小二乘判别分析是通过测量传感器阵列和由正确分类矢量组成的类关系矩阵提取数据并建立两种矩阵关系模型的有监督模式识别[24]。 是一种将二进制变量描述的类别分类变量设为Y变量， 预测变量设为X变量的偏最小二乘回归方法[25]。 对二阶导数红外光谱1 800～500 cm-1波段进行偏最小二乘判别分析， 前6个主成分累计贡献率达到85.5%， 可以代表样品红外光谱大部分信息。 图4为主成分t1， t2， t3组成的三维图， 图中同一物种聚集在一起， 不同物种之间能清晰地区分开。

图3 主成分分析3D得分图

图4 偏最小二乘判别3D得分图

2.5 系统聚类与结果分析

系统聚类分析又称层次聚类分析， 使用距离算法和分类算法确定样品光谱数据的相关程度并根据研究样品间相关程度大小进行类别聚合的多元统计分析方法[26]。 结果通过树状图显示出来， 具有简洁、 直观的优点。

通过对比主成分分析与偏最小二乘判别分析3D得分图， 发现偏最小二乘判别分析对不同物种区分效果优于主成分分析。 把偏最小二乘判别分析得到的前6个主成分数据， 作为三七及其野生近缘种红外光谱提取数据代入SPSS20.0软件进行系统聚类分析[27]。 利用ward联接的方法， 以平方Euclidean距离为度量标准处理数据， 得到了三七及其野生近缘种亲缘关系树状图(图5)。

由图5可知不同物种在不同的距离聚成一类， 绝大多数三七个体在距离系数为1处聚为一类， 全部珠子参个体在距离系数为1处聚为一类， 绝大多数越南人参个体在距离系数为1处聚为一类， 绝大多数屏边三七个体在距离系数为4处

图5 系统聚类亲缘关系图

聚为一类， 全部羽叶三七个体在距离系数为3处聚为一类。 在聚类树状图中三七、 屏边三七、 越南人参有4个个体聚类错误， 这可能是由于同一物种生存环境不同而造成的化学成分积累差异导致的。 在物种层面， 三七与越南人参在距离系数为6处聚为一类， 珠子参与越南人参、 三七在距离系数为7处聚为一类， 屏边三七与三七、 越南人参、 珠子参在距离系数为10处聚为一类。 不同物种之间聚类结果显示， 三七与越南人参、 珠子参亲缘关系较近， 与屏边三七、 羽叶三七亲缘关系较远。 与三七亲缘关系由近到远为： 越南人参、 珠子参、 屏边三七、 羽叶三七。 这一结果与张金渝等[28]利用EST-SSR技术研究三七与珠子参及屏边三七亲缘关系结果相一致。

3 结 论

采用傅里叶变换红外光谱法测定三七及其野生近缘种(珠子参、 屏边三七、 越南人参、 羽叶三七)、 三七总皂苷标准品的红外光谱。 结果显示， 三七与三七总皂苷标准品红外光谱在3 400， 2 930， 1 635， 1 385， 1 075， 927 cm-1等附近存在多个共有峰， 推测三七共有峰强度可能与皂苷含量有关。 五个物种原始红外光谱较为相似， 通过对原始图谱进行自动基线校正、 平滑、 纵坐标归一化、 二阶导数预处理后发现， 在指纹区(1 800～500 cm-1)不同物种红外光谱具有差异， 物种之间吸收峰峰数、 峰强、 峰型差异较大。 对预处理红外光谱数据进行主成分分析以及偏最小二乘判别分析发现， 偏最小二乘判别分析对不同物种的区分效果优于主成分分析， 偏最小二乘判别分析前6个主成分累计贡献率达到85.5%， 可以代表样品红外光谱大部分信息。 将前6个主成分数据进行系统聚类分析， 得到三七与其野生近缘种亲缘关系由近到远为： 越南人参、 珠子参、 屏边三七、 羽叶三七。 说明越南人参、 珠子参与三七亲缘关系较近， 可以在三七种质资源开发利用研究中优先考虑。 傅里叶变换红外光谱结合化学计量学方法可以有效地对三七及其野生近缘种进行亲缘关系研究； 为三七的品种改良及种质资源开发利用提供研究基础， 同时为药用植物种质资源相关领域提供借鉴和参考。

[1] Ng T B. Journal of Pharmacy and Pharmacology, 2006, 58(8): 1007.

[2] Zhou S L, Xi G M, Li Z Y, et al. Journal of Integrative Plant Biology, 2005, 47(1): 107.

[3] YANG Chong-ren, CHEN Ke-ke, WANG Dong, et al(杨崇仁, 陈可可, 王 东, 等). The 9th National Academic Symposium on Medicinal Plants and Plant Medicine(第九届全国药用植物及植物药学术研讨会论文集), 2010: 26.

[4] ZHANG Zi-long, WANG Wen-quan, YANG Jian-zhong, et al(张子龙, 王文全, 杨建忠, 等). Soils(土壤), 2010, 42(6): 1009.

[5] Maxted N, Ford-Lloyd B V, Jury S, et al. Conservation, 2006, 15(8): 2673.

[6] LU Bao-rong(卢宝荣). Chinese Science Bulletin(科学通报), 2014, (6): 479.

[7] Brar D S, Khush G S. Plant Molecular Biology, 1997, 35(1-2): 35.

[8] SUN Yu-qin, CHEN Zhong-jian, ZHOU Shi-liang, et al(孙玉琴, 陈中坚, 周世良, 等). China Journal of Chinese Materia Medica(中国中药杂志), 2009, 34(20): 2567.

[9] Amirabadizadeh H, Jafari A, Mahmoodzadeh H. Nordic Journal of Botany, 2015, 33(2): 159.

[10] Martins S, Simões F, Matos J, et al. Plant Systematics and Evolution, 2014, 300(5): 1035.

[11] Sharma S K, Dawson I K, Waugh R. Theoretical and Applied Genetics, 1995, 91(4): 647.

[12] Cheng C, Liu J, Zhang C, et al. Applied Spectroscopy Reviews, 2010, 45(2): 148.

[13] Fan Q, Chen C, Lin Y, et al. Journal of Molecular Structure, 2013, 1051: 66.

[14] Kwon Y K, Ahn M S, Park J S, et al. Journal of Ginseng Research, 2014, 38(1): 52.

[15] Yap K Y L, Chan S Y, Lim C S. Journal of Biomedical Science, 2007, 14(2): 265.

[16] Demir P, Onde S, Severcan F. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy, 2015, 135: 757.

[17] Mariey L, Signolle J P, Amiel C, et al. Vibrational Spectroscopy, 2001, 26(2): 151.

[18] ZHANG Zhi-xin, ZHANG Shi-xiu(张志信, 张仕秀). Lishizhen Medicine and Materia Medica Research(时珍国医国药), 2012, 23(12): 3126.

[19] SUN Su-qin(孙素琴). Analysis of Traditional Chinese Medicine by Infrared Spectroscopy(中药红外光谱分析与鉴定). Beijing: Chemical Industry Press(北京： 化学工业出版社), 2010.

[20] Li D, Jin Z, Zhou Q, et al. Journal of Molecular Structure, 2010, 974(1): 68.

[21] Abdi H, Williams L J. Wiley Interdisciplinary Reviews: Computational Statistics, 2010, 2(4): 433.

[22] Mellado-Mojica E, López M G. Food Chemistry, 2015, 167: 349.

[23] Luna A S, da Silva A P, Pinho J S A, et al. Food Research International, 2015, 67: 206.

[24] Ciosek P, Brzózka Z, Wróblewski W, et al. Talanta, 2005, 67(3): 590.

[25] Pérez-Enciso M, Tenenhaus M. Human Genetics, 2003, 112(5-6): 581.

[26] Demir P, Onde S, Severcan F. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy, 2015, 135: 757.

[27] Qiu L, Wang Z, Liu P, et al. Spectroscopy Letters, 2015, 48(2): 120.

[28] ZHANG Jin-yu, YANG Wei-ze,CUI Xiu-ming, et al(张金渝, 杨维泽, 崔秀明, 等). Journal of Plant Genetic Resources(植物遗传资源学报), 2011, 12(2): 249.

Study on the Genetic Relationship ofPanaxNotoginsengand Its Wild Relatives Based on Fourier Translation Infrared Spectroscopy

LI Yun1, 2, WANG Yuan-zhong2, YANG Wei-ze2, YANG Shao-bing2, ZHANG Jin-yu1, 2*, XU Fu-rong1*

1. College of Traditional Chinese Medicine, Yunnan University of Traditional Chinese Medicine, Kunming 650500, China

2. Institute of Medicinal Plants, Yunnan Academy of Agricultural Sciences, Kunming 650200, China

Fourier transform infrared spectroscopy;Panaxnotoginseng; Wild relatives; Genetic relationship; Germplasm resources

May 17, 2015; accepted Sep. 8, 2015)

2015-05-17，

2015-09-08

国家自然科学基金项目(81260610， 81460581)资助

李 运， 1993年生， 云南中医学院中药学院硕士研究生 e-mail: liyunsci@163.com *通讯联系人 e-mail: jyzhang2008@126.com； xfrong99@163.com

O657.3

A

10.3964/j.issn.1000-0593(2016)08-2420-05

*Corresponding authors