两种氨氯地平苯磺酸片采用LC-MS检测法的人体生物等效性评价

陈印　黄莹　曹巧林　方惠枝　冯敏良

两种氨氯地平苯磺酸片采用LC-MS检测法的人体生物等效性评价

陈印黄莹曹巧林方惠枝冯敏良

【摘要】目的建立测定人血浆氨氯地平苯磺酸浓度的液相色谱-串联质谱(LC-MS)检测方法，同时分析两种氨氯地平苯磺酸片的生物等效性。方法选取16名健康受试者，单剂量交叉口服10 mg苯磺酸氨氯地平供试制剂或参比制剂，用标准二阶段交叉设计自身对照试验方法，采用LC-MS法测定服药后不同时间点的血药浓度，计算其主要药物动力学参数并进行生物等效性评价。结果苯磺酸氨氯地平供试制剂和参比制剂主要药代动力学参数如下:Cmax分别为(6.841±2.871)、(7.301±2.911) ng/ml，AUC0-t分别为(234.56±56.14)、(249.89±59.24) ng·h－1·ml－1，Tmax分别为(7.032±0.771)、(7.066±0.731) h，t1/2分别为(34.68±5.171)、(35.81±5.147) h。两制剂主要药动学参数之间比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。结论本方法快速、简单、准确，结果表明两种制剂具有生物等效性。

【关键词】氨氯地平苯磺酸; LC-MS;生物等效性

氨氯地平苯磺酸(amlodipine besylate)为第三代长效双氢吡啶类钙拮抗药，是心绞痛和高血压等心血管疾病治疗的常用临床药物［1］。与其他同类型药物相比，该药具有有生物利用度高、口服吸收好、不受食物影响、服药量低、药效维持时间长等特点。目前，氨氯地平苯磺酸已被人们作为心绞痛和高血压临床治疗的一线药物［2］。因为氨氯地平溶解于血浆十分困难，其血浆水平极低，普通检查手段很难准确测定该药物的血浆浓度［3］。本文建立了一种准确、灵敏、操作简捷的LC-MS检测方法，并对两种氨氯地平苯磺酸片进行药动学及生物等效性评价。

1　材料与方法

1.1药品与试剂供试制剂:氨氯地平苯磺酸片(江西汇仁药业有限公司生产，规格:5 mg/片，批准文号:国药准字H20065056)，参比制剂:络活喜(辉瑞制药有限公司(大连)生产，规格:5 mg/片，批准文号:国药准字H10950224)。选用中国药品生物制品检定所供给的苯磺酸氨氯地平对照品，含量:99.8%;杭州民生药业集团有限公司生产的尼莫地平(内标)对照品，含量:99.8%，甲醇、乙腈均为色谱纯，天津康科德科技有限公司生产;其他试剂均为分析纯。

1.2仪器岛津Agilent1200HPLC系统和Bruker Esquire HCT离子阱质谱仪高效液相色谱-质谱联用仪，电喷雾离子化接口(ESI)的四极杆质谱检测器、Metabolite ToolsTM软件色谱工作站; 1810B型自动双重纯水蒸馏器、美国热电ST16R台式冷冻离心机、XW-80A型涡旋混匀机。

1.3液相色谱条件色谱柱Phenosphere C18柱，150 mm×2.1 mm，5 μm;流动相为A:5.0 mmol/L醋酸铵缓冲液，B:乙腈，A∶B= 74∶26(V/V)。流速:0.25 ml/min，柱温:37.5℃，进样量:10 μl［4］。

1.4质谱条件离子化方式:气动辅助电喷雾离子化(ESI)，喷雾电压:5 000 V;选择性离子监测(SIM) :检测离子为正离子，用于氨氯地平苯磺酸定量分析的离子反应分别为m/z 409→m/z 238 (氨氯地平)，用于尼莫地平定量分析的离子反应为m/z419.1→343.1。测定方法进行过系统性实验，满足要求［5］。

1.5血浆样品处理取1 ml空白血浆，加入20 μl 1 mg/ml内标尼莫地平溶液，后再加入1 mol/L氢氧化钠溶液25 μl，涡旋混匀1 mn;加入5 ml乙醚-二氯甲烷混合液(V∶V= 2∶1)涡旋3 min，离心10 min (8 000 r/min)，取上层有机相，氮气吹干，加100 μl流动相复溶，涡旋混匀，离心10 min(12 000 r/min)，取20 μl上清，进样［6］。

1.6标准曲线的配制精确吸取一定量苯磺酸氨氯地平的对照品溶液和20 μl内标尼莫地平溶液，用1 ml空白血浆稀释成氨氯地平的浓度为0.5、1.0、1.5、2.0、5.0、10.0、20.0 ng/ml的血浆系列溶液。经上述血浆样品预处理步骤进液相，记录分析结果。

1.7血浆样品采集及处理16名健康男性受试者，年龄21～27岁，平均年龄(24.1±1.2)岁，体重56～75 kg，平均(64±6) kg;身高166～179 cm，平均(171.9±4.3) cm。试验前均询问病史，体格检查和实验室检查均正常，2周内未服用任何可能影响本品吸收、代谢的药物。采用双周期两制剂随机交叉试验设计，16名健康受试者禁食12 h，10 mg单次口服给予苯磺酸氨氯地平供试制剂或参比制剂，受试者给药后在0 h (给药前)和1.0、2.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、12.0、24.0、48.0、72、96、120.0 h静脉取血3 ml，置于肝素离心管中，离心(1 500 r/min×15 min)，分取血浆，于－70℃低温冰箱中保存待测。2周后交叉服药，按相同时间点取血，按上述方法处理血样。取出冰箱中样品，依次按照“1.5”步骤进行血浆样品预处理，处理进液相分析。

1.8药动学参数计算方法以3P97程序经计算机拟合测得的血药浓度-时间数据，用WinNonlon 5.0软件进行计算药代动力学参数。

1.9统计学分析应用SPSS 15.0统计软件，计量资料以±s表示，采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1色谱行为采用液相色谱-串联质谱(LC-MS)检测方法测定氨氯地平苯磺酸血药浓度，该法专属性强，灵敏度高，分离效果良好，血浆中内源性物质无干扰，内标尼莫地平和氨氯地平的保留时间分别约为2.01、3.12 min。

2.2标准曲线及系统性实验以氨氯地平峰面积比内标尼莫地平面积(Y)为纵坐标，氨氯地平浓度X为横坐标，进行回归计算，得标准曲线回归方程:Y= 0.1326C +0.017，r= 0.9989。线性范围为0.5～20.0 ng/ml，日内变异系数(RSD)均小于5%;日间变异系数(RSD)均小于5%;相对回收率均在95%～105%以内;样品处理回收率均在80%以上。0.5、10、20.0 ng/ml的苯磺酸氨氯地平其日内回收率(RSD)分别为6.30%，4.65%，1.09%;日间回收率(RSD)分别为7.31%，5.68%，1.44%;方法回收率分别为(102.68±7.48)%，(96.79±3.67)%，(99.38± 6.41)%。见表1。

表1　不同浓度苯磺酸氨氯地平的回收情况　%

2.3药代动力学参数测量受试者给药后在0 h (给药前)和1.0、2.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、12.0、24.0、48.0、72、96、120.0 h的血浆中氨氯地平浓度，通过3P97程序经计算机拟合测得的血药浓度-时间数据和药代动力学参数。见表2，图1。

表22组大鼠灌胃给予氨氨氯地平后的主要药动学参数n=12，±s

参数　供试制剂　参比制剂　P值Cmax(ng/ml)6.841±2.871　7.301±2.911　0.327 tmax(h)　7.032±0.771　7.066±0.731　0.449 t1/2(h)　34.68±5.171　35.81±5.147　0.270 AUC0-t(ng·h－1·ml－1)　234.56±56.14　249.89±59.24　0.229 AUC0-∞(ng·h－1·ml－1)244.32±62.12　265.23±68.78　0.187

3　讨论

氨氯地平口服后人体吸收速度较为缓慢，一般需要6～8 h才可达到药物峰浓度，其在人体内代谢的半衰期为30 h左右，表明氨氯地平口服后，需要较长的时间发挥药理学效应，故其服用方法多为1次/d，其主要是为了提高服药的顺应性。通常采用HPLC-UV法和HPLC-ECD法测量氨氯地平的血药浓度［7］。氨氯地平治疗高血压时使用剂量较低，其血药浓度低，采用HPLC-UV法很难准确测量其血药浓度，而HPLC-ECD法操作的影响因素较多，一般难于操作。LC-MS检测法是一种灵敏度高、专属性强、准确性好的最新体内分析方法，其能检测到纳克级水平药物浓度。而且因为氨氯地平的血药浓度极低，普通的高效液相色谱分析无法获得满意的效果。本文考察了测定氨氯地平苯磺酸的液相色谱-串联质谱(LC-MS)检测方法，该法的最低检测线为0.1 ng/ml(根据信噪比S/N=3所得)，且在0.5～20.0 ng/ml范围内线性良好，不需要对样品使用二级质谱联用，该方法可以简单、灵活和准确的测量人体内血浆中氨氯地平苯磺酸的浓度。

因为人体内血浆内源性物质种类繁多复杂，其可干扰氨氯地平检测的结果，因此，在测量该药物的血药浓度前需预先进行血样处理［8］。我国对苯磺酸氨氯地平测定前血样预处理的常用方法为采用多种有机溶剂进行多步骤或者固相萃取处理掉样本中多种成分。考虑氨氯地平稳定性较差，需较短时间完成对其的检测，故本文选用有机溶剂萃取法，该法较固相萃取法明显简化了样品的处理过程，而且该方法的干扰因素少，特异度好，特别是该方法的灵敏度和精密度符合人们对人体内血药浓度检测和要动力学研究的要求，即满足了保证人体内血药浓度处于极低的水平，但可进行大量的样本分析。氨氯地平为双氢吡啶类钙拮抗药，结构含有碱性含氮杂环，因此碱化血样能减少氨氯地平的水溶性，提高其提取回收率，本文首先适度碱化1 mol/L氢氧化钠，提高氢氧化钠的回收量。本文还观察了常用有机溶剂的回收情况，结果发现乙醚-二氯甲烷混合液(V∶V=2∶1)的提取回收率最高，样品处理回收率均在80%以上。本文选取了0.5、10、20 ng/ml三种浓度考察该法的精密度和回收率，结果显示日内变异系数(RSD)均小于5%;日间变异系数(RSD)在 5%以下;相对回收率均在95%～105%以内。因此LC-MS法适用于测定人血浆氨氯地平苯磺酸浓度。

图1　受试者口服给予两种氨氯地平苯磺酸后中血药浓度-时间曲线

本文为了尽可能提高试验的客观准确性，减少受试个体间的误差，故进行双周期两制剂随机交叉试验设计。对两种氨氯地平苯磺酸片的药动学参数分析，结果显示，供试制剂和参比制剂的Cmax分别为(6.841±2.871、(7.301±2.911) ng/ml，AUC0-t分别为(234.56±56.14)、(249.89±59.24) ng·h－1·ml－1，Tmax分别为(7.032±0.771)、(7.066±0.731) h，t1/2分别为(34.68±5.171)、(35.81±5.147) h，两制剂主要药动学参数之间比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。与相关研究结果［9］一致。因此，两种制剂的生物等效性相当。

综上所述，本文建立测定人血浆氨氯地平苯磺酸浓度的液相色谱-串联质谱(LC-MS)检测方法，该法快速、简单、准确。这两种氨氯地平苯磺酸片的生物等效性相当。

参考文献

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9张志锋，李婧，肖红涛，等.HPLC-MS-MS法测定人血浆中苯磺酸氨氯地平的浓度及其药动学.西南民族大学学报·自然科学版，2009，35:776-780.

【中图分类号】R 945.2

【文献标识码】A

【文章编号】1002－7386(2016) 02－0290－03

doi:10.3969/j.issn.1002－7386.2016.02.044

作者单位:518109广东省深圳市龙华新区人民医院药剂科

(收稿日期:2015－05－04)