PLGA-TPGS负载α-TIF-siRNA纳米粒对疱疹病毒1的抑制作用

杨成明　王可斌

·论著·

PLGA-TPGS负载α-TIF-siRNA纳米粒对疱疹病毒1的抑制作用

杨成明王可斌

【摘要】目的研究以PLGA-TPGS生物可降解材料为载体包载α-TIF-siRNA的纳米粒对HSV1的抑制作用。方法以PLGA-TPGS为载体，采用双乳蒸发法制备包载α-TIF-siRNA的PLGA-TPGS纳米粒(命名为PLGA-TPGS/α-TIF-siRNA NPs)，并对其进行表征，包括粒径大小、zeta电位、包封率和释放率，用MTT法检测纳米粒对上皮细胞和HeLa细胞的细胞毒作用，免疫荧光观察纳米粒在细胞内的释放，用空斑实验研究体外研究纳米粒对HSV1病毒的抑制作用。结果PLGA-TPGS/α-TIF-siRNA NPs的粒径大小为(257±2.94) nm，zeta电位为(－31.25±1.70) mV，siRNA的包封率为(56.23±3.68)%，纳米释放siRNA呈双相，即在96 h释放达到50%，之后呈缓慢释放，用MTT法分析PLGA-TPGS/α-TIF-siRNA NPs对原代角质形成细胞和HeLa细胞几乎无细胞毒性。荧光显微镜能观察纳米粒siRNA细胞内释放。PLGA-TPGS/α-TIF-siRNA NPs能明显延长抑制感染HeLa细胞的HSV1。结论PLGA-TPGS纳米粒可以作siRNA的载体。PLGA-TPGS/α-TIF-siRNA NPs在体外对HSV1病毒具有明显的抑制作用，可以成为治疗HSV1-诱导的角膜炎在内的相关疾病的候选药物。

【关键词】单纯疱疹病毒1(HSV1);α基因反式诱导因子(α-TIF);纳米粒，siRNA

项目来源:广东省医学科研基金项目(编号:A2013616);广东省深圳市创新委知识创新计划项目(编号:JCY20130327094102249，JCY20140411091643396)

单纯疱疹病毒1(HSV1)是双链DNA病毒，是一种重要的病原体，常导致慢性感染、潜伏感染，在一定条件下重新激活而复发。HSV1感染可引起不同临床症状，包括无症状的感染、唇疱疹、角膜炎等。HSV1感染是致盲的重要原因。在HSV1感染细胞中，极早(IE或α)基因表达被α基因反式诱导因子(alphagene trans-inducing factor，α-TIF)反式激活［1－3］。HSV-αTIF含2个不同的原件:一个和Oct-1和CFF结合，有助于结合TAATGARAT基序，另一个则被赋予转录激活。由于HSV1的感染反复发作，现有的核苷类药物常常产生药物耐受，因此，寻求新的治疗方法非常必要。siRNA沉默常导致基因表达减少，可以作为新型药抑制剂，但siRNA本身难以进入细胞，需要载体，这可能导致对机体的毒副作用。纳米载体因其制备简单、高效，较病毒性载体等相对安全，毒副作用低，无免疫原性和具有缓释作用受到广泛关注。我们曾用PLGA-TPGS负载地塞米松治疗结节型角膜炎，实验证明较地塞米松眼药具有滞留时间长，治疗效果较好的特点［4］。在本研究中，我们以PLGA-TPGS作为载体制备含α-TIFsiRNA的PLGA-TPGS纳米粒，对其进行表征，包括粒径大小、zeta电位、包封率、稳定性等，在体外研究包载α-TIF siRNA的PLGA-TPGS纳米粒对HSV1的抑制作用，为HSV1感染导致的相关疾病提供一种候选药物制剂。

1　材料与方法

1.1材料与试剂PLGA-TPGS共聚体由清华大学深圳研究生院梅林教授提供。Poly (vinyl alcohol) (PVA;80%水化)，3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl) -2，5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT )购自Sigma-Aldrich (St.Louis，MO，USA)。4’，6-Diamidino-2-phenylindole dihydrocloride(DAPI)购自VECTOR(Burlingame，CA，USA)，RPMI培养基购自Gibco公司，胎牛血清(FBS)购自杭州四季青生物公司，HSV1病毒由中国科学院武汉病毒研究所提供，其他试剂均为分析纯试剂。HeLa细胞和Vero细胞购自武汉大学典型物种保存中心。未标记的和用荧光FAM标记的α-TIF-siRNA序列由上海吉玛公司设计并合成。其序列为:正链:5’-CGCUAUGUACCAUGCUCGAUATT-3’，反意义链:5’-UAUCGAGCAUGGUACAUAGCGTT-3’。Mock siRNA由吉玛公司提供。

1.2方法

1.2.1负载siRNA的PLGA-TPGS纳米粒的制备:采用双乳蒸发法制备负载siRNA的PLGA-TPGS纳米粒。简单描述如下:溶于DEPC-处理的20 μmol/L siRNA 50 μl用含5 mg的PLGA-TPGS 250 μl的二氯化碳(CH2Cl2)通过超声乳化60 s，获得油包水的乳液，然后加入1 ml 2% (W/V) PVA，混合物超声12次(超声5 s停止5 s)，形成水-油-水(w1/o/w2)双乳液。接着用5 ml 2% (w/v) PVA稀释，并在室温下搅拌1.5 h，蒸发二氯化碳。最后，纳米悬液在4℃以18 000 g离心15 min，用6 ml无RNase水洗2次，除去PVA和未游离的siRNA，真空冷冻干燥。Mock-siRNA的PLGATPGS纳米粒的制备同上。

1.2.2纳米粒的鉴定:用动态光散射仪(dynamic light scattering，DLS，Zetasizer Nano ZS90，Malvern Instruments Ltd.，Malvern，UK)检测纳米粒的粒径大小。1 mg纳米粒以0.5 mg/ml的浓度溶解在DEPC-处理的去离子水中。纳米粒的zeta电位用激光多普勒技术检测(Zetasizer Nano ZS90)。纳米粒用去离子水稀释确保纳米粒的zeta电位在低离子强度下能准备被鉴定。多聚体的最终浓度为1 mg/ml。用扫描电镜检测纳米粒的形态学(SEM)。所有测量重复3次。

1.2.3评估包载siRNA的纳米粒的包封效率:负载siRNA纳米粒的包封效率是指被包载在纳米粒内的siRNA占最初加入的总siRNA的百分比。1 mg在250 μl氯仿中加入500 μl TE缓冲液，然后在室温下旋转30 min，在4℃以18 000×g离心20 min从有机相提取siRNA进入水相。用UV分光光度计260 nm处检测siRNA的浓度。

1.2.4体外释放实验:大约负载siRNA的PLGATPGS纳米粒1 mg悬在1 ml pH值7.4以DEPC处理的PBS缓冲液，37℃在漩涡器上以100 r/min。在指定的时间点上，在4℃以12 000 r/min离心20 min除去上清，纳米粒再用缓冲液重悬。上清中的siRNA用UV紫外分光光度计在260 nm检测。

1.2.5细胞培养:原代角质形成细胞的培养。包皮放置于含有庆大霉素浓度为(20 μg/ml)的DPBS(不含Ca2 +和Mg2 +)冲洗液中约1 h，包皮剪成2～4块并转移到含25.0 U/ml中性蛋白酶的DBPS中18 h，角质形成细胞的表皮层从真皮层分离下来后，转移到加有5～10 ml 0.05%胰蛋白酶-EDTA的60 mm有盖培养皿中，在36℃孵育约15 min，在这个过程中，每2～3分钟使用2 ml的移液管吹打以帮助细胞解离。胰蛋白酶活性使用10 ml大豆胰蛋白酶抑制剂(Cat.No.17075) (10 mg/ml)终止。细胞悬液转移到15 ml无菌离心管，在室温下40 g离心5 min后，去上清，用DMEM培养基重悬细胞。以3×106细胞接种到75 cm2组织培养瓶中，加入DMEM完全培养基，置于37℃5% CO2培养箱中培养。HeLa细胞的培养按照常规细胞的方法进行。

1.2.6包载荧光标记siRNA的PLGA-TPGS纳米粒的荧光显微镜下的观察:HeLa细胞以每孔2×105每孔接种在6孔细胞培养板上，在37℃5% CO2培养24 h。为了观察标记的siRNA被细胞摄取，把包载荧光FAM标记siRNA的纳米粒加入到培养的细胞后继续培养，在不同时间点用荧光显微镜观察纳米粒被细胞摄取和siRNA的释放。细胞用PBS洗涤3次，用4%甲醛室温下固定20 min。细胞核用DAPI室温下避光染色5 min，然后用荧光显微镜观察(Fluoview FV-1 000，Olympus Optical Co.，Ltd.，Tokyo，Japan)。

1.2.7纳米粒对细胞的细胞毒作用:用MTT方法检测检测纳米粒在不同浓度下对原代培养的角质形成细胞和HeLa细胞的细胞毒作用。简单地说，以每孔1× 104细胞接种在96-细胞培养板中培养，孵育24 h。然后用不同浓度的裸siRNA，空纳米粒和siRNA-αTIFPLGA-TPGS纳米粒(5 μg/ml)加到细胞培养孔中，每个浓度3个复孔。24 h后，每孔中加入20 μl MTT (5 mg/ml)水溶液，继续培养4 h，然后除去培养基，加入100 100 μl DMSO溶解MTT。细胞活性通过检测490 nm的吸光度。

1.2.8HSV-1感染培养的单层细胞:HeLa细胞以104细胞/cm2的密度接种在35 mm的培养皿，细胞长到75%汇合。除去培养基，用1×PBS洗涤单层。HSV-1用含2%的胎牛血清稀释后以0.2感染复数(moi)感染细胞，在37℃孵育2 h后，除去培养基，用含10%胎牛血清的新鲜培养基替换继续培养。第2天加入纳米粒αTIF-siRNA-loaded-PLGA-TPGS (5 μg/ml)，Mock-siRNA-loaded-PLGA-TPGS(5 μg/ml)，无环鸟苷(ACV，1 μg/ml)到HSV1感染的细胞培养物中，以HSV1感染细胞和未感染细胞为对照，加药后的第3天和第5天从感染的上清液收集子代病毒，580 g 15 min离心除去细胞碎片。用空斑实验检测病毒滴度。病毒的空斑实验采用的细胞为Vero细胞，操作按照病毒学实验手册。

1.3统计学分析应用SPSS 16.0统计软件，计量资料以±s表示，采用t检验，P＜0.05为差异有统计意义。

2　结果

2.1纳米的鉴定我们以前用合成的PLGA-TPGS能够制备负载地塞米松纳米粒，并证明PLGA-TPGS/ DEX纳米粒能够对兔后段疾病的治疗效果优于单纯的地塞米松［4］。在本研究中，我们尝试用PLGA-TPGS为材料，采用双乳蒸发法制备负载siRNA的PLGATPGS纳米粒。我们对其进行了表征。用DLS测其粒径大小分别为:空纳米粒(183.56±1.75) nm，siRNA-loaded PLGA-TPGS纳米粒为(257±2.94) nm。空纳米粒的zeta电位为(－20.57±1.48) mV，siRNA-loaded PLGA-TPGS纳米粒zeta电位为(－31.25±1.70) mV，差异有统计学意义(X2值分别为0.429、0.318，P＜0.05)。扫描电镜分析表明siRNA-loaded PLGA-TPGS纳米粒呈球形，大小较为均一，表面较光滑，用电镜检测的siRNA-loaded PLGA-TPGS纳米粒同DLS的检测结果较为一致。见表1，图1。

图1　扫描电镜观察siRNA-loaded PLGA-TPGS纳米粒的形态和大小

表1　2组siRNA-loaded PLGA-TPGS纳米粒比较±s

表1　2组siRNA-loaded PLGA-TPGS纳米粒比较±s

组别　粒径大小(nm) (n=5)多分散性(n=5)载药量(%)包封率(%) Zeta电位(mV) (n=5) A组183.56±1.75　0.135　0　0　－20.57±1.48 B组　257.00±2.94　0.269　4.32±0.78 56.23±3.68　－31.25±1.70

2.2体外释放siRNA-loaded PLGA-TPGS的体外释放在PBS缓冲液(pH值7.4)中进行研究。在不同时间点0、6、12、24、48、72、96、120、144和168 h在260 nm用紫外分光光度计检测siRNA的释放。在第96 h pH值7.4 siRNA的释放率为(52.30±3.06)%，随后几天释放平缓。见图2。

图2　siRNA-loaded PLGA-TPGS在体外pH值7.4的PBS中的释放

2.3荧光显微镜观察用荧光显微镜观察纳米粒被细胞摄取后siRNA在细胞内的释放。FAM荧光标记的siRNA纳米粒加入到细胞培养基中后6 h没有观察到荧光，但12 h后siRNA-loaded PLGA-TPGS纳米粒中释放的siRNA在细胞内可以观察到，到72 h细胞内荧光强度继续增加。荧光主要集中在核周胞质中。见图3。

图3　siRNA-loaded PLGA-TPGS纳米粒在HeLa细胞中不同时间的释放; A直接在荧光显微镜观察标记FAM-siRNA，B用DAPI染料染细胞核，C将A和B汇合的结果

2.4细胞活性分析用MTT实验检测siRNA-loaded PLGA-TPGS纳米粒对细胞的细胞毒。siRNA-loaded PLGA-TPGS纳米粒(5 μg/ml)在24 h和72 h对原代角质形成细胞和HeLa细胞几乎无细胞毒，mock-siRNA-PLGA-TPGS纳米粒和PLGA-TPGS空纳米粒也呈类似的趋势。这表明生物可降解材料PLGA-TPGS对细胞毒性非常弱。见图4。

图4　纳米粒对原代角质形成细胞和HeLa细胞的24 h和72 h细胞毒作用

2.5α-TIFsiRNA-loaded PLGA-TPGS纳米粒对HSV1病毒的抑制作用为了观察α-TIFsiRNA-loaded PLGA-TPGS纳米粒对HSV1的抑制作用。首先我们以感染复数(moi)为0.2的HSV1感染单层细胞后12 h，以不同浓度的纳米粒加到培养液中，以PBS作为空白对照，在第3天和第5天收集培养上清，再用空斑形成实验检测HSV1的病毒量。同预期的一致，PBS、空纳米粒和mock-siRNA-PLGA-TPGS纳米粒在各个浓度对HSV1没有抑制作用。α-TIFsiRNA-loaded PLGA-TPGS纳米粒较PLGA-TPGS/Mock纳米粒明显具有HSV1的抑制作用(t=0.324，P＜0.01)。在HSV1感染的前3 d无环鸟苷对HSV1抑制较为显著，但后来的3 d抑制作用减弱。而α-TIFsiRNA-loaded PLGA-TPGS纳米粒对HSV1的抑制前3 d没有无环鸟苷显著，第5天对HSV1的抑制作用较无环鸟苷强，可能因为纳米粒的缓释作用。见图5、6。

图5　空斑实验A，未感染的Vero细胞; B.HSV1感染的Vero细胞; C.无环鸟苷(2 μg/ml)处理的HSV1感染的Vero细胞; D.PLGATPGS/Mock纳米粒处理的HSV1感染的Vero细胞; E.PLGATPGS/α-TIF siRNA纳米粒处理的HSV1感染的Vero细胞

图6　用空斑实验定量各处理因素对HSV1病毒的影响

3　讨论

HSV感染细胞的病毒基因表达通过即早或者HSV-αTIF结合α基因启动子反式激活启动［5］。HSV-aTIF的C末端含一个已鉴定的激活结构域，可以和TFIIB、TAFII40和复合物的其他成员接触加快转录复合物的组装［6－10］。

在α疱疹病毒亚科的几个成员，包括HSV-2［11，12］、EHV-1［13］和EHV［14］、Marek病病毒［15］、VZV［16］和BHV-1［17］存在HSV-αTIF的同源性。除了HSV-2-αTIF外，在C末端没有一个和HSV-αTIF有明显的同源性。尽管有这些差异，但所有αTIF蛋白能反式激活α基因启动子。HSV-αTIF的N末端存在惟一和其他αTIFs同源域，具有非独立的反式激活能力; HSV-αTIF完全依赖它的C末端。Wu等［18］通过研究表明αTIF缺乏激活结构域，可以结合Oct-1后结合在TAATGARAT基序。因此，HSV-αTIF可以作为药物作用的候选靶标。因为尚未报道靶向HSV-αTIF的小分子化合物，而且现有证据表明HSV1临床分离株对这些小分子化合物，如ACV，产生耐受［19］。SiRNA能够激活内源性RNA干扰途径，介导序列特异的基因沉默。但是，裸siRNA很难进入细胞，而且在体外易于降解，传统的转染试剂毒性大。因此，开发传递siRNA的载体能克服上述siRNA用于临床面临的限制。

在我们以前的研究中，PLGA-TPGS包载地塞米松的纳米粒的粒径大小为200 nm，zeta电位为－21 mV，治疗眼后段疾病的较地塞米松更显著［4］。在本研究中，我们尝试用PLGA-TPGS作为包载siRNA的载体，我们采用双乳蒸发法成功地制备了α-TIFsiRNA-loaded PLGA-TPGS纳米粒，粒径为257 nm，ζ电位为－31 mV，包封率为56%，这些指征和包载地塞米松的PLGA-TPGS纳米粒不一致，可能因为包载的分子不同，地塞米松是脂溶性，而siRNA是水溶性的，而且带负电荷，这可能导致α-TIFsiRNA-loaded PLGA-TPGS纳米粒较载地塞米松的纳米粒粒径大，电荷也较低，包封率较低。但它们在体外药物释放动力学均呈双相分布，即早期呈爆发性释放，其后呈缓慢释放。扫描电镜观察α-TIFsiRNA-loaded PLGA-TPGS纳米粒呈较为均一分布，表面较为光滑。这些特征证明了我们成功采用双乳蒸发法制备了包载α-TIFsiRNA-loaded PLGATPGS纳米粒。用MTT方法证明了在浓度为5 μg/ml的纳米粒对原代角质形成细胞和HeLa细胞的细胞毒性较弱，表明合成的纳米粒材料PLGA-TPGS对细胞毒性较弱，适合作为药物传递的材料。PLGA-TPGS包载FAM-标记的siRNA纳米粒被细胞摄取后在12 h可以看到荧光，表明纳米粒在细胞内释放了siRNA，更进一步证明了PLGA-TPGS可以作为载体包载siRNA成为纳米粒能在细胞内发挥作用。

在本研究中，我们用PLGA-TPGS为载体包载HSV1 α-TIF siRNA制备纳米粒，为了研究其抗HSV1的功能。HSV1感染HeLa细胞单层后12 h加入纳米粒，结果表明α-TIFsiRNA-loaded PLGA-TPGS纳米粒能够抑制HSV1，并且能够持续较长时间，因为纳米粒对siRNA具有缓释作用。尽管无环鸟苷也能抑制HSV1，但持续时间较短，而且目前HSV1出现了对无环鸟苷的耐受毒株，这限制了无环鸟苷的使用。

总之，我们用PLGA-TPGS共二聚体为载体成功地制备了α-TIFsiRNA-loaded PLGA-TPGS纳米粒，该纳米粒可以较长时间抑制HSV1，这为治疗包括HSV1引起的角膜炎和HSV1相关的疾病提供了候选抗病毒药物。

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Inhibitory effects of alpha-TIF siRNA-loaded PLGA-TPGS nanoparticles on herpesviruses 1

YANG Chengming*，WANG Kebin.*Department of Ophtalmology，Xili People’s Hospital of Nanshan District of Shenzhen City，Guangdong，Shenzhen 518055，China

【Abstract】Objective To investigate the inhibitory effects of alpha-TIF siRNA-loaded PLGA-TPGS nanoparticles on herpesviruses 1(HSV1).Methods The novel biodegradable PLGA-TPGS nanoparticles (NPs) were prepared as a delivery system of small interfering ribonucleic acid (siRNA) targetingα-TIF for inhibiting HSV1，and its characteristics including size，zeta potentials，entrapment rate and in vitro release rate were represented.The cytotoxicity of α-TIF siRNA-loaded PLGA-TPGS nanoparticles on epithelial cells and HeLa cells was examined by MTT assay.The inhibitory effect of thenanoparticleson HSV1 was detected by barren spot assay.Results The size，zeta potential of PLGA-TPGS/α-TIF-siRNA NPs was (257±2.94) nm and (31.25±1.70) mV，respectively.The entrapment rate of siRNA was (56.23±3.68)%，and the in vitro release of NPs displayed biphase kinetics，that is，which reached 50% on 96 hours，then，it was slowly released.The cytotoxicity of PLGA-TPGS/α-TIF-siRNA NPs on primary keratinocytes or HeLa cells was not observed by using MTT assay.The release of SiRNA located in NPs was observed by using fluorescent microscope.PLGA-TPGS/α-TIF-siRNA NPs could inhibit HSV1 replication in HeLa cells.ConclusionPLGA-TPGS nanoparticles can be used as siRNA carrier.PLGA-TPGS/α-TIF-siRNA NPs can inhibit HSV1 replication in vitro，which may become candidate drugs for HSV1 infection －related diseases including keratitis.

【Key words】herpesviruses 1; alpha-gene trans-inducing factor; nanoparticles; siRNA

【中图分类号】R 373.4

【文献标识码】A

【文章编号】1002－7386(2016) 02－0165－05

doi:10.3969/j.issn.1002－7386.2016.02.001

作者单位:518055广东省深圳市南山区西丽人民医院眼科(杨成明);广东省深圳市南山区人民医院泌尿外科(王可斌)

(收稿日期:2015－01－06)