硫酸盐还原菌的驯化及硫酸盐降解动力学研究

段　黎， 皮科武

(湖北工业大学资源与环境工程学院， 湖北 武汉 430068)

硫酸盐还原菌的驯化及硫酸盐降解动力学研究

段黎， 皮科武

(湖北工业大学资源与环境工程学院， 湖北 武汉 430068)

[摘要]为了有效处理酸性矿山废水(Acid Mineral Drainage, AMD)，获得耐低pH的硫酸盐还原菌(Sulphate Reducing Bacteria, SRB)，先在pH为7的条件下用Postgate's C培养基对SRB进行富集培养，然后逐步降低培养基中的pH值，依次在pH为6.5、6.0、5.5、5.0、4.5、4.0的Postgate's C培养基中驯化培养SRB，对驯化过程中溶液的pH和硫酸盐浓度进行测定，并对硫酸盐的降解过程进行动力学拟合。结果表明，经驯化后SRB可以在pH为4的环境中生长，驯化传代后的SRB在pH为4的条件下pH上升到5.0左右，硫酸盐的去除率达到38%，驯化效果比较明显。硫酸盐的降解速度模型符合指数速度模型，且培养基中起始pH越低，降解速率越慢。

[关键词]硫酸盐还原菌；驯化；硫酸盐；降解动力学

AMD是一类低pH、含高浓度硫酸盐和可溶性重金属离子的废水，如果不经处理直接排入水体中，会使受纳水体酸化，对河流中的水生生物造成极大的危害；另外，重金属离子由于无法被降解，一旦进入环境中后就会不断累积而难以去除，还会破坏土壤结构，造成环境的长期污染。因此，有效治理酸性矿山废水是一个亟待解决的重大问题[1]。

用SRB处理AMD可以还原硫酸根，提高废水pH及去除重金属[2-3]。SRB处理酸性废水的作用机理为：通过还原硫酸盐，产生硫化物，同时在硫酸盐降解的过程中会产生碱度，从而会让酸性废水中pH上升；另外废水中的金属离子与反应生成的S2-结合产生沉淀，由此降低废水中金属离子的浓度。

SRB利用有机物将SO42+还原，提高pH，去除金属离子的过程可表示为：

(1)

(2)

(3)

其中，CH2指能提供电子的各种有机碳源物，如葡萄糖、氨基酸等；M2+指容易与硫化物产生沉淀的金属阳离子，如Cu2+、Fe3+、Mn4+等[4-6]。本实验以SRB法处理AMD为背景，在不同pH条件下对SRB进行逐步驯化，以得到耐酸性的SRB，并对驯化过程中硫酸盐浓度的变化进行曲线拟合，对降解过程进行动力学分析。

1材料与方法

1.1菌种来源

硫酸盐还原菌菌种由武汉理工大学资源与环境工程学院实验室提供。

1.2培养基

采用Postgate's C培养基，培养基各成分的质量浓度为：KH2PO4，0.5 g/L；CaSO4，l.0 g/L；NH4Cl 1.0 g/L；FeSO4·7H2O，0.01 g/L；Na2SO4，4.5 g/L；CaCl2·6H2O，0.06 g/L；MgSO4·7H2O，0.06g/L；柠檬酸钠，0.3 g/L；乳酸钠，3.5 g/L；酵母浸膏，1.0 g/L。20%NaOH调pH值[7]。

1.3pH的测定

在培养驯化的过程中每天用注射器在厌氧培养瓶中取样，测定pH值的变化。

1.4SO42+浓度的测定

采用铬酸钡分光光度法[8]。在酸性溶液中，铬酸钡与硫酸盐生成硫酸钡沉淀，并释放出铬酸根离子。反应后溶液中剩余的铬酸钡和生成的硫酸钡沉淀可通过过滤除去。铬酸根离子在碱性条件下呈现黄色，测定其吸光度可知硫酸盐的含量。用注射器在厌氧培养瓶中取20 mL水样于锥形瓶中，向其中加入l mL 2.5 mol/L盐酸溶液，加热煮沸5 min 左右；取下后再加2.5 mL铬酸钡悬浊液，再煮沸5 min 左右；稍冷后，逐滴加入(1+1)氨水至溶液呈柠檬黄色，再多加2 滴，待溶液完全冷却后过滤，用50 mL比色管收集滤液，然后用蒸馏水稀释到刻度线。在420 nm 波长下，用10 mm比色皿，测定吸光度。用同样方法以硫酸根标准溶液的吸光度做标准曲线，然后通过标准曲线计算硫酸根含量。

1.5实验仪器设备

722N可见分光光度计, 上海光谱仪器有限公司；电子天平, 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；PHS-3C pH计, 上海精密科学仪器有限公司；SKY-2102恒温摇床, 上海苏坤实业有限公司；SHZ-DIII真空抽滤装置, 巩义市予华仪器有限责任公司；DL-1电子万用电炉, 北京市永光明医疗仪器厂。

2实验及结果

2.1SRB富集培养

用250 mL的厌氧培养瓶，Postgate's C培养基配置好，调节pH至7后，转入厌氧培养瓶中，用高纯的氮气排氧15 min，在35℃摇床中预热1 h，将采集的厌氧泥水混合物以10%的接种比例转入其中，再次用N2排氧15 min，最后将厌氧瓶在35℃转速为120 r/min的摇床中暗室培养10 d左右至培养基颜色变黑，且用醋酸铅试纸条置于瓶口测试，试纸变黑，说明此时已获得了富集菌液。在培养过程中每天用注射器在厌氧瓶中取20 mL液体测定其pH值和SO42+质量浓度。图1是pH和SO42+质量浓度的变化情况。

(a)pH变化

(b)SO42+质量浓度变化图 1　在pH为7的条件下培养时pH和SO42+质量浓度

从图1可看出SRB在最适pH条件下生长时，从开始培养到第8天左右pH保持稳定持续上次，从起始值7.0上升到8.0左右，培养液中SO42+的起始浓度是1600 mg/L，培养到第8天时，SO42+浓度降低到200 mg/L，SO42+的去除率达到88%。第9天、第10天pH和SO42+浓度几乎没变化，可能是厌氧培养瓶中营养物质消耗殆尽，SRB的活性降低。

2.2SRB驯化培养

以Postgate's C培养基为基础培养，逐步降低pH驯化SRB，用20%H2SO4调菌液pH，使pH降低，观察菌的生长情况，当培养基颜色变黑，且用醋酸铅试纸条置于瓶口测试，试纸变黑时，转入pH更低的培养基中，以此培养方法最终获得能耐受低pH的SRB，依次在pH=6.5、6.0、5.5、5.0、4.5、4.0的培养基以10%的接种比例转入其中，在35℃转速为120 r/min的摇床中暗室培养。根据富集培养过程中pH和SO42+浓度的变化情况，8 d以后营养物质消耗殆尽，因此每个批次培养8 d，在培养过程中每天用注射器在厌氧瓶中取20 mL液体测定其pH值和SO42+浓度。图2是驯化过程中不同起始条件下pH的变化情况。

图 2　不同起始pH条件下pH的变化

由图2可知，起始pH为6.5 、6的培养液中，8 d后溶液中pH均上升到8左右，pH为5.5、5.0分别上升到7和6，而pH为4.5的培养液中pH上升到5.0，pH为4.0的培养液中pH上升到4.3，说明pH为4的培养液中SRB生长速率慢，代谢不旺盛，这是因为过酸的环境均对SRB的生长有显著抑制作用。

(a)pH=6.5时

(b)pH=6.0时

(c)pH=5.5时

(d)pH=6.0时

(e)pH=4.5时

(f)pH=4.0时图 3　不同起始pH条件下SO42+的变化及去除率

图3是不同起始pH条件下SO42+的变化及去除率，可见pH=6.5、6.0、5.5、5.0、4.5、4.0的条件下培养8 d之后SO42+的去除率分别为73.7%、66.8%、54.5%、48.1%、26.1%、15.4%，说明pH值越低越不利于硫酸盐的降解。

2.3SBR驯化后的传代培养

在250 mL的厌氧培养瓶，Postgate's C培养基配置好后，调节pH至4后，以10%的接种比例将驯化至pH为4的菌液转入其中，在35℃转速为120 r/min的摇床中暗室进行传代培养。在培养过程中每天用注射器在厌氧瓶中取20 mL液体测定其pH值和SO42+质量浓度。图4是pH和SO42+浓度的变化。由图4可知传代后pH值8 d后上升到5.0左右，SO42+的去除率为38%，比pH为4驯化第一代硫酸盐降解效果明显。

(a)pH变化

(b)SO42+质量浓度变化图 4　pH为4的SRB传代后pH和SO42+的变化及去除率

图5是驯化前后SO42+去除率的比较，可知未经驯化的SRB在pH为4的条件下培养时SO42+去除率为0.9%，硫酸盐几乎没有降解，这是因为过酸的环境不利于SRB的生长，对微生物的代谢有抑制作用。而驯化初期，第一代驯化的耐酸性SRB的SO42+去除率最后达到15%，由此传代后SRB的SO42+去除率达到38%，说明驯化达到了比较明显的效果。

图 5　驯化前后SO42+去除率的比较

3硫酸盐降解的动力学分析

为了进一步了解在SRB的作用下硫酸盐降解的过程，对硫酸盐降解速率进行了动力学分析。根据实验结果进行曲线拟合，将实际降解时间t(d)作为自变量x，SO42+质量浓度(mg/L)作为因变量y，拟合结果如图6所示。

图 6　SO42+质量浓度随时间变化曲线

硫酸盐降解的关系式为

SO42+= A0+ A1t+ A2t2+A3t3+ A4t4

各参数和相关系数如表1所示。

假设硫酸盐的降解速度模型符合指数速度模型[9]，指数速度的数学模型为

(1)

式中：v为降解速度；K为速度常数，它表示单位浓度的反应速度，又称反应比速；n为反应级数；c为SO42+质量浓度,mg/L；t为硫酸盐降解时间,d。

对式(1)两边取对数得

lgV=lgK+nlgc

(2)

由lgc对lgV进行一元线性回归，通过计算SO42+降解过程的速度，并对其速度和浓度求对数，再对数据进行拟合，求取降解过程中反应级数n和速率常数K的曲线(图7)。

表1　SO42+浓度变化参数

(a)pH=7.0时

(b)pH=6.5时

(c)pH=6.0时

(d)pH=5.5时

(e)pH=5.0时

(f)pH=4.5时

(g)pH=4.0时图 7　不同起始pH条件下SO42+降解动力学拟合曲线

表2说明硫酸盐的降解速度模型符合指数速度模型，且起始pH越低，K值越小，表示降解速度越慢。因为硫酸盐的降解是SRB的作用，而微生物的生长代谢受pH的影响很大，pH越低，越不利于SRB的生长，进而不利于硫酸盐的降解。

表2　不同起始pH条件下SO42+降解动力学拟合参数

表2中的各项相关系数R2均大于0.97，说明拟合度高。

4结论

本实验采用Postgate's C培养基，在35℃厌氧的环境下，通过逐步降低培养基中pH值对SRB分批驯化培养，对培养液中的pH和硫酸盐浓度变化情况进行分析比较，并对硫酸盐降解的过程进行了动力学研究。研究结果表明，经驯化后，SRB能在pH为4的条件下生长，硫酸盐的去除率能达到15%，传代后硫酸盐的去除率能达到38%，而没有经过驯化的SRB在pH为4的条件下几乎不能生长，硫酸盐去除率仅为0.9%，说明驯化过程对SRB的耐低pH生长能力有显著效果。

[参考文献]

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[3]赵宇华, 刘学东. 硫酸盐还原菌及其影响因子[J]. 环境污染与防治, 1997(19):41-3.

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[8]彭艳平, 余水静, 赖和劲. 硫酸盐还原菌生长条件优化及驯化试验研究[J]. 江西理工大学学报, 2013, 34(3): 6-10.

[9]殷士学. 环境微生物学[M]. 北京：机械工业出版社，2006，159-162.

[责任编校： 张众]

Study on the Domestication of Sulphate Reducing Bacteria and the Kinetics of Sulphate Degradation

DUAN Li, PI Kewu

(1SchoolofResourcesandEnvironmentalEngin.,HubeiUniv.ofTech.,Wuhan430068,China)

Abstract：In order to obtain the Sulphate reducing bacteria which can grow under the condition of low pH to deal with low pH acid mine waste water effectively, the SRB was first enriched and cultured on the Postgate's C medium at pH 7. Then the pH value of the medium was gradually reduced, and the SRB was respectively acclimated and cultured on Postgate's C medium at pH 6.5, 6, 5.5, 5, 4.5, 4. In the process of domestication, the pH and sulphate concentration were determined, and the kinetics of the degradation of sulphate concentration was fitted. The results showed that the SRB can grow in the environment of pH 4. After domestication, the pH increased to about 5 under the condition of pH 4, and the removal rate of sulphate reached 38%, and the effect of domestication was obvious. The degradation rate of the sulphate was in accord with the exponential velocity model. The lower the initial Ph is, the slower the degradation rate is.

Keywords：SRB; domestication; sulphate; degradation kinetics

[收稿日期]2016-01-15

[作者简介]段黎(1991-)， 女，湖北天门人，湖北工业大学硕士研究生，研究方向为酸性矿山废水处理技术与设备

[文章编号]1003-4684(2016)02-0116-05

[中图分类号]X522

[文献标识码]：A