分子影像学技术诊断结肠癌的研究进展

张 玲， 屈亚威， 谈 涛， 舒 娟， 刘敏黎， 刘海峰

武警总医院消化内科，北京 100039

分子影像学技术诊断结肠癌的研究进展

张 玲， 屈亚威， 谈 涛， 舒 娟， 刘敏黎， 刘海峰

武警总医院消化内科，北京 100039

结肠癌是我国常见的恶性肿瘤之一，白光内镜难以发现较小的病灶而易造成漏诊。分子影像学可对人体内部生理或病理过程在分子水平上无创或微创实时成像，有望实现肿瘤的早期诊断。本文就分子影像学在结肠癌诊断的研究进展作一概述。

分子影像学；结肠癌；自体荧光内镜；拉曼光谱内镜；荧光分子成像；共聚焦激光显微内镜

结肠癌是我国常见的恶性肿瘤之一，目前，结肠镜检查是诊断结肠癌的主要方法，但白光内镜难以发现形态学特征不明显或较小的病灶而造成漏诊。随着内镜技术的发展，各种特殊内镜如放大内镜、染色内镜、窄带成像技术等被应用于临床，在一定程度上提高了早期结肠癌的诊断率，但仍难以实现高灵敏性、高特异性的肿瘤早期诊断。分子影像学可对人体内部生理或病理过程在分子水平上无创或微创实时成像，有望实现肿瘤的更早期诊断，将其与消化内镜结合的内镜分子影像学，成为实现肿瘤早期诊断的有效途径，其中，自体荧光内镜、拉曼光谱内镜、荧光分子成像及共聚焦激光显微内镜研究进展较快，且其在前期实验及临床的应用展现了良好的发展前景，本文就分子影像学在结肠癌诊断的研究进展作一概述。

1 自体荧光成像(autofluoscence imaging，AFI)诊断结肠癌的研究

迄今为止，AFI在诊断各类消化道肿瘤中，应用最广泛的是诊断结肠癌。Matsuda等[1]的队列研究将167例待检者随机分为AFI-白光内镜序贯检查组(83例)和白光内镜-AFI序贯检查组(84例)，结果显示AFI发现息肉100枚，而白光内镜发现息肉73枚，AFI漏诊率显著低于白光内镜。Ramsoekh等[2]的前瞻性研究对待检者采用白光内镜-AFI或AFI-白光内镜的序贯检查方法，发现与白光内镜相比，AFI诊断Lynch综合征和家族性结肠癌的结肠腺瘤敏感性更高。Aihara等[3]发明了一种实时定量色调分析软件，采用“绿红比”和“颜色对比指数”指标鉴别结肠肿瘤性和非肿瘤性病变，并证实以“绿红比”值1.01为界(≥1.01为非肿瘤性病变，<1.01为肿瘤性病变)，颜色对比指数以13.94为界(<13.94为非肿瘤性病变，≥13.94为肿瘤性病变)，其诊断的敏感性、特异性分别高达98.8%、86.4%和98.8%、90.9%。

近年来，AFI技术已越来越多地应用于临床诊断消化道肿瘤，认为AFI对消化道恶性肿瘤的诊断具有高度敏感性，对检出形态特征不明显的病变较普通内镜具有更大的优势，对提高早癌的检出率具有重要意义[4]。但AFI技术仍存在一些不足，如自体荧光信号较微弱，AFI的内镜图像分辨率较低，使病灶显示相对模糊，影响诊断；消化道黏膜炎症和增生性病灶同样可使黏膜层增厚，在AFI下显示出近似于肿瘤病变的色调，从而影响炎性病灶与肿瘤病灶的鉴别诊断等。随着影像系统的日益完善，如自体荧光激发光源的优化选择、内镜影像传感器照相机灵敏度的进一步提高，自体荧光内镜成像技术将可能成为一种普通的辅助诊断工具。另外，如何把快速、超分辨率显微技术引入现有的荧光成像内镜系统，以实现细胞及亚细胞水平的显微诊断是自体荧光技术发展的新趋势。

2 拉曼光谱内镜(Raman spectroscopy endomicroscopy，RSE)诊断结肠癌的研究

拉曼光谱有较高的分子特异性，可通过探查病变部位的拉曼光谱特征而作出定性诊断，自2000年首次与内镜结合以来，迅速成为内镜分子成像的研究热点。

近红外拉曼光谱技术已被广泛应用于人体多种器官的在体或离体的肿瘤诊断中，并取得了有意义的研究成果[5-6]。Molckovsky等[7]研究了近红外拉曼光谱鉴别结肠腺瘤性息肉和增生性息肉的潜力，同时首次探讨了内镜下近红外拉曼光谱区分结肠息肉的潜力，并获得了100%的灵敏度，89%的特异性和95%的准确性。Widjaja等[8-10]分别应用不同的统计技术研究了离体结肠组织的拉曼光谱，探讨了正常组织与癌组织的光谱差异，结果表明拉曼光谱可以用来区分正常组织与癌组织，这些研究结果为临床上肿瘤的在体和早期诊断提供了依据。

普通拉曼信号较弱，表面增强拉曼光谱(surface-enhanced Raman scattering，SERS)可使信号增强106～1014倍，具有极高的灵敏度和分辨率[11-12]，可实现单分子检测，目前已被广泛应用于人体组织、细胞、血液的检测分析。Lin等[13]使用金纳米颗粒作为表面增强拉曼光谱的探针，获得结肠癌患者的血清生物化学信息，结果显示结肠癌患者血清样品与健康人群相比生物分子的改变。以腺嘌呤表面增强拉曼光谱峰强度比率达到725 cm-1，酪氨酸达到638 cm-1为标准，经验诊断算法诊断结肠癌的敏感性及特异性分别为68.4%及95.6%，主成分分析(principal components analysis,PCA)-费希尔线性判别分析(linear discri minant analysis,LDA)诊断算法诊断结肠癌的敏感性和特异性分别为97.4%、100%。结果表明以金纳米颗粒作为探针的表面增强拉曼光谱联合PCA-LDA对结肠癌无创性检查具有极大潜力。目前，癌胚抗原(carcino-embryonic antigen，CEA)是唯一一个推荐用于结肠癌患者常规临床检测的分子标志物[14]，被广泛应用于结肠癌和其他胃肠道肿瘤的筛查、判断疗效、检测复发和转移，基于此，席刚琴等[15]将制备的SERS探针与CEA单克隆抗体结合形成SERS免疫探针，将此探针与结肠癌组织切片上相应的抗原发生特异性结合，并进行SERS检测和成像，结果显示结肠癌腺上皮高表达CEA，间质及正常上皮基本不表达CEA，结果表明，SERS标记抗体检测分析技术具有高灵敏度和高特异性，有望应用于结肠癌组织切片中蛋白质表达的分析，成为结肠癌辅助诊断的一种重要方法。Ito等[16]收集胃癌、结肠癌及良性病变患者的血液样本，加入覆盖纳米级六方形银的磷青铜芯片(NHC)，用波长为632.8 nm激发光照射，结果显示良性病变患者血液样本的光谱峰高度明显低于胃癌或结肠癌患者，而胃癌和结肠癌患者之间无明显差异，此研究为癌相关肿瘤标志物的检测提供了一种简便快速的方法。

拉曼光谱能够提供所研究组织的分子/化学信息，使它在分子成像领域更具有竞争力，除了化学特异性，在成像方面，拉曼光谱还有其他较好的特性，如较高的空间分辨率、较好的复用能力[17]、低背景信号和极好的耐光性等[18]，但也存在一些不足，如扫描速度相对缓慢、缺乏客观的数值分析软件、拉曼光谱的信号较弱，这也是严重阻碍其生物医学应用的关键因素，随着技术的不断完善和多种拉曼探针的研发与应用，为克服以上不足提供了新的途径。

3 荧光分子成像(fluorescent luminescence imaging，FLI)诊断结肠癌的研究

FLI用于肿瘤组织成像，开创了在活体水平上无创、实时、高特异性、高灵敏度地进行肿瘤病灶检测的新领域，已在多种肿瘤研究中得到广泛应用。Liu等[19]用Cy5.5标记氨基酸序列为QPIHPNNM的肽后，进行结肠腺瘤小鼠模型成像，信号-背景比为3.42±1.30，结果表明这种近红外肽对结肠腺瘤有高度特异性，获得的图像可以达亚细胞水平，因此，局部应用近红外对比剂标记的肽可能提高结肠腺瘤及平坦型和凹陷型病变的检出率。Mitsunaga等[20]研究发现，γ-谷氨酰转肽酶在结肠癌细胞中高表达，可催化酶活化探针发出荧光，小动物活体实验证明局部喷洒酶活化探针后，5 min可探查到直径<1 mm的结肠癌病灶。基于Thomsen-Friedenreich(TF)抗原在结肠癌组织中高表达，而在正常结肠组织中几乎不表达，Sakuma等[21]研究中设计能与结肠癌组织TF抗原特异结合的探针，并将其局部应用到鼠原位结肠癌模型中，分别用白光内镜及荧光内镜成像，特异性探针与TF抗原显示出较好的特异性。结果显示，荧光内镜能发现传统内镜不易发现的病变，且可以检测化疗过程中TF表达的动态改变。

作为一种新兴的分子成像手段，FLI具有成像速度快、灵敏度高、费用低廉、无电离辐射等优点，用于对生物体内肿瘤的发生、转移、肿瘤血管生成及肿瘤药物治疗反应等进行实时、非侵入式特异性跟踪和探测，可以从分子、细胞水平上研究肿瘤内发生的一系列生理病理变化，为今后临床实践进行肿瘤的早期诊断、靶向治疗、术中成像及抗肿瘤新药的研发提供了有效的工具。目前，荧光内镜的研究主要在动物模型上进行，这为今后的临床研究奠定了基础。如果未来可以将FLI与内窥镜技术联合应用于临床手术中，进行实时辅助术中成像，将有利于提高肿瘤检测的灵敏度和手术成功率，在临床治疗中有广阔的应用前景。

4 共聚焦激光显微内镜(confocal laser endomicroscopy，CLE)诊断结肠癌的研究

CLE是本世纪发明并应用于临床的一种新型内镜技术，使在一次检查中同时获取内镜诊断和病理诊断成为可能。Kiesslich等[22]研究表明，共聚焦图像对上皮内瘤样变和结肠癌诊断的敏感性和特异性分别为97.4%和99.4%，准确性为99.2%，提示CLE对结肠肿瘤的普查具有重要意义，是进行实时活细胞组织学诊断的新型工具，对临床早期肿瘤的检出有重要价值。

结合特异性荧光靶向探针的CLE成像，诊断的准确性更高，实现了内窥靶向荧光显微镜的功能。Hsiung等[23]通过筛选噬菌体肽库，选择一种能与人癌前组织有较高亲和力的特异七肽序列VRPMPLQ，并用荧光素标记，对接受结肠镜检查的患者局部注射后，用CLE进行靶向成像，结果显示，病变部位的荧光信号强度较邻近正常细胞明显增强，其敏感性和特异性分别为81%和82%。基于表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)信号通道不规则激活和结肠肿瘤恶变行为有很大的关系，Liu等[24]局部应用能特异结合EGFR的荧光分子探针后，CLE局部成像，结果显示，在37例活体分子成像中，在结肠癌、结肠腺瘤患者检测到荧光信号的比例分别为18/19、12/18，而在10例正常黏膜处几乎没有或仅有很微弱的荧光信号。肿瘤组织的微循环以扩张、扭曲、囊性血管网的形成为特点，因此，对肿瘤血管的成像并确定其形态特征，是实现优化肿瘤靶向血管治疗即抗血管生成疗法目标的前提之一。Cioclteu等[25]用共聚焦激光显微内镜评估被荧光标示的抗CD31抗体标记正常结肠血管和结肠癌新生血管的形态学参数，结果显示，肿瘤血管的平均直径和密度均显著大于正常组织，其迂曲指数和长度无显著不同，结果均通过免疫组化证实。此研究证明，与传统免疫组化相比，CLE可以检测更多相关肿瘤血管参数，这对进一步结肠肿瘤的诊断和治疗具有重要意义。

对普通内镜下怀疑为结肠恶性病变的患者，CLE诊断的敏感性较高，且其诊断与分级诊断与组织病理学有较高的一致性，尤其是探针CLE的应用。虽然CLE展现出了巨大的临床和科研应用价值，但仍有许多问题需要解决：CLE的操控性不如常规内镜，由于胃蠕动、呼吸、心跳等方面的影响，在共聚焦图像中易出现伪像，且共聚焦内镜价格昂贵，这也成为限制CLE临床应用的主要因素。

综上所述，将分子影像学技术与消化内镜结合，在内镜检查的同时从分子水平上检测病变，对提高结肠癌的早期检出率有巨大价值。但在这些成像方式中，没有单一的某一种方式是完美的，每一种都有它的优势和不足，如探针CLE的穿透深度及局部应用抗体的渗透深度是限制其临床应用的重要原因之一，但是，深层组织的成像可以通过近红外探针或应用小分子抗体来实现，因此，随着新技术不断出现为克服现有不足提供新途径的同时，各种成像技术的联合应用也将逐渐成为一种趋势。相信在不久的将来，内镜分子影像学在消化系肿瘤的诊疗中会发挥更加重要的作用。

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(责任编辑：陈香宇)

Progress of molecular imaging in diagnosis of colorectal cancer

ZHANG Ling, QU Yawei, TAN Tao, SHU Juan, LIU Minli, LIU Haifeng

Department of Gastroenterology, General Hospital of Chinese People’s Armed Police Forces, Beijing 100039, China

Colorectal cancer is one of the common malignant tumors, it is difficult for white light endoscopic to find small lesions, which leads to miss diagnosis. Molecular imaging can reach real-time imaging at molecular level non-invasive or minimally invasive in processes of physiology or pathology, expected to achive the early diagnosis of the tumor. This article reviewed the progress of molecular imaging in diagnosis of colorectal cancer.

Molecular imaging; Colorectal cancer; Autofluoscence imaging; Raman spectroscopy endomicroscopy; Fluorescence luminescence imaging; Confocal laser endomicroscopy

10.3969/j.issn.1006-5709.2016.08.032

首都临床特色应用研究(Z141107002514099)

张玲，硕士，研究方向：结肠肿瘤。E-mail：944039904@qq.com

刘海峰，博士，教授，主任医师，研究方向：消化道早癌。E-mail：haifengliu333@163.com

R735.3+5

A

1006-5709(2016)08-0952-04

2015-11-02