应用SNP标记高效鉴定黄瓜杂交种纯度

姚丹青，朱文莹，张微微，楼坚锋，潘俊松

(1.上海市种子管理总站，上海　201103；2.上海交通大学，上海　200240；3.上海农林职业技术学校，上海　201699)



应用SNP标记高效鉴定黄瓜杂交种纯度

姚丹青1，朱文莹2，张微微3，楼坚锋1，潘俊松2

(1.上海市种子管理总站，上海201103；2.上海交通大学，上海200240；3.上海农林职业技术学校，上海201699)

摘要以71个市售黄瓜品种为材料，应用高分辨率熔解曲线技术筛选可用于黄瓜纯度检验和品种鉴定的SNP位点，并通过焦磷酸测序验证，得到14个SNP位点，这些位点在71个市售黄瓜品种中的多态信息量为0.079～0.528。为确保结果的准确性，利用该鉴定方法检测黄瓜杂交种F1的94粒种子，结果显示，Chr0108等6个SNP位点检测的种子纯度均为100%，且鉴定结果与SSR标记检测方法相符。表明，对供试样品同时进行这6个SNP位点的检测分析，能够更加可靠、准确、高效地鉴定其纯度，并可用于DUS测试分析，为今后葫芦科作物的品种审定和新品种保护等工作奠定基础。

关键词黄瓜；种子纯度；SNP标记；高分辨率熔解曲线；焦磷酸测序

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)，是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，主要有密度高、遗传稳定性好、具有代表性、分析易自动化等特性，已成为继SSR之后的第3代分子标记，近年来被广泛应用于蔬菜分子辅助育种及品种鉴定。Jung 等[1]利用Allele Specific PCR(AS-PCR)方法从COSⅡ (conserved ortholog setⅡ) 标记中筛选出40个辣椒SNP位点，能完全鉴定17个甜椒品种和81个辣椒品种中的79个。赵婷婷[2]利用SNP标记技术筛选出基因 Cf-9的单碱基突变位点，获得含有番茄抗叶霉病基因 Cf-9的番茄材料，为培育新抗病品种提供物质基础。宋伟等[3]根据多态性水平、染色体位置等信息从公共数据库中筛选了48个玉米核心SNP位点，并通过基因分型分析，找到42个可以用来鉴别105份自交系材料的SNP位点。在葫芦科作物中，Wim 等[4]从甜瓜公共EST数据库发掘获得45个SNP位点，丰富了甜瓜基因遗传图谱，并结合SNP标记和焦磷酸测序技术用于甜瓜品种鉴定。兰青阔等[5]建立了基于CLA6位点(A/G)的黄瓜杂交种纯度鉴定方法，并用该方法检测出黄瓜杂交种‘优一’种子的纯度。李欧静等[6]分析了SNP位点CLA13 (C/G)在16个黄瓜育种材料中的多态性，建立了3 Pooling SNP Pyrosequencing检测分析模型。

目前，已报道的SNP检测和标记开发技术有许多种，如基于构象改变的SSCP、DGGE、DHPLC等,基于杂交的TaqMan、microarray等，以及基于引物延伸的DNA测序如焦磷酸测序等[7]。尽管方法众多，但分别存在开发通量低、操作繁琐、费用高、适用范围有限等问题，限制了SNP标记在非模式生物中的开发和利用。近年来，高分辨率熔解曲线(high resolution melting，HRM)被证明是一种通量大、效率高的SNP检测技术[8]，其原理是基于不同等位形式对退火温度Tm的影响，通过熔解曲线的变化确定基因型。另外，可应用非标记探针进行HRM检测，从而大幅降低SNP标记开发成本[9]。焦磷酸测序技术是实时、定量分析DNA序列的新一代测序技术，是基于引物引导的多聚酶延伸下的核酸合成的新型DNA测序技术[10]，具有操作简单、结果准确和自动化程度高等优点，特别适合SNP等段序列分析，具有较高的灵敏性和准确性，可用于SNP分型分析。本研究利用HRM技术筛选黄瓜SNP位点，结合焦磷酸测序技术进行SNP分型验证，为建立基于SNP标记的黄瓜杂交种纯度检测和品种鉴定技术奠定基础。

1材料与方法

1.1试验材料

选用71个黄瓜杂交品种为试验材料，其详细特征见表1。

1.2DNA 提取

71个市售黄瓜品种每个品种取子叶，液氮冷冻研磨，加入CTAB 裂解缓冲液(20 g/L CTAB, 1.4 mol/L NaCl,0.1 mol/L Tris-HCl,20 mmol/L Na2EDTA)500 μL，65 ℃恒温水浴裂解30 min，后续DNA提取纯化按树脂型基因组DNA提纯试剂盒(北京塞百盛基因技术有限公司)操作进行。提取的DNA取1 μL 样品于Nanodrop 2000 C微量分光光度计上进行DNA质量浓度检测。DNA 提取后质量浓度统一稀释至50 mg/L。

表1　市售黄瓜品种来源及特征特性

(续表1Continued table 1)

序号No.品种名称 Cultivars品种类型 Type产地 Seedsource果皮颜色 Colour41碧丰二号Bifeng2华北型NorthChinatype辽宁Liaoning深绿Deepgreen42春秋碧翠Chunqiubicui华北型NorthChinatype辽宁Liaoning深绿Deepgreen43星杂二号Xingza2华北型NorthChinatype辽宁Liaoning深绿Deepgreen44粤丰园青瓜Yuefengyuancucumber华北型NorthChinatype广东Guangdong深绿Deepgreen45种都三号Zhongdu3华北型NorthChinatype四川Sichuan深绿Deepgreen46世纪星温室黄瓜Shijixinggreenhousecucumber华北型NorthChinatype辽宁Liaoning深绿Deepgreen4781138113华北型NorthChinatype山东Shandong绿Green48冬春二王子Dongchunerwangzi华北型NorthChinatype山东Shandong深绿Deepgreen49夏丰一号Xiafeng1华北型NorthChinatype山东Shandong深绿Deepgreen50早丰一号Zaofeng1华北型NorthChinatype辽宁Liaoning深绿Deepgreen51西兴黄瓜2号Xixingcucumber2华南型SouthChinatype山东Shandong亮绿Brilliantgreen52深春Shenchun华南型SouthChinatype广东Guangdong亮绿Brilliantgreen53申青一号Shenqing1华南型SouthChinatype上海Shanghai亮绿Brilliantgreen54富华二号Fuhua2日韩型JapanandSouthKoreatype山东Shandong亮绿Brilliantgreen5585F12华南型SouthChinatype山东Shandong亮绿Brilliantgreen56鲁黄瓜三号Lucucumber3华南型SouthChinatype山东Shandong亮绿Brilliantgreen57绿衣天使Lüyitianshi华南型SouthChinatype山东Shandong翠绿Emerald58绿王Lüwang华南型SouthChinatype辽宁Liaoning亮绿Brilliantgreen59吉保Jibao华南型SouthChinatype山东Shandong深绿Deepgreen60萃斯五号Cuisi5华南型SouthChinatype辽宁Liaoning亮绿Brilliantgreen61南杂2号Nanza2华南型SouthChinatype上海Shanghai亮绿Brilliantgreen62宝杂2号Baoza2华南型SouthChinatype上海Shanghai亮绿Brilliantgreen63鲁美一号Lumei1华南型SouthChinatype山东Shandong亮绿Brilliantgreen64珍宝大胡瓜Zhenbaocucumber加工型Processingtype广东Guangdong墨绿Blackgreen65新万吉青瓜Xinwanjicucumber加工型Processingtype广东Guangdong墨绿Deepgreen66玉光迷你Yuguangmini欧洲温室型Europeangreenhousetype北京Beijing绿色Green67碧玉二号Biyu2欧洲温室型Europeangreenhousetype上海Shanghai碧绿Azuregreen68小泉一郎Xiaoquanyilang欧洲温室型Europeangreenhousetype北京Beijing半白绿色Whiteandgreen69中农19号Zhongnong19欧洲温室型Europeangreenhousetype北京Beijing亮绿Brilliantgreen70萃斯二号Cuisi2欧洲温室型Europeangreenhousetype辽宁Liaoning亮绿Brilliantgreen71京海绿美Jinghailümei欧洲温室型Europeangreenhousetype北京Beijing暗绿Sapgreen

1.3引物设计及合成

通过查询NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)、葫芦科基因组网站(CuGenDB，http://www.icugi.org/cgi-bin/ICuGI/index.cgi)数据库获得42个候选SNP位点，平均分布在黄瓜7条染色体上。HRM和焦磷酸测序引物使用软件PyroMark Assay Design 2.0设计，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，上下游引物纯化级别为HPLC，测序引物纯化级别为ULTRAPAGE。

1.4高分辨率熔解曲线(HRM)检测

HRM检测在Qiagen real-time PCR system上进行。PCR扩增采用20 μL反应体系，其中10×Taqbuffer 2 μL，25 mmol/L Mg2+2.2 μL，10 mmol/L dNTP mix 0.6 μL，上下游引物(浓度为10 μmol/L)各0.2 μL，DNA 模板2 μL(质量浓度为90 mg/L)，5 U/ μLTaqPloymerase 0.4 μL，20×Evagreen(Biotium Corporation)1 μL，双蒸水补足 20 μL。

反应程序为 95 ℃预变性5 min；35个循环反应(95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s,72 ℃ 20 s)，降温至65 ℃，并逐步上升至95 ℃。

1.5焦磷酸测序验证

针对HRM筛选得到的SNP 位点，设计引物(PyroMark Assay Design 2.0软件)，包括PCR 正向引物PCR-F、反向引物PCR-R 和测序引物Sequencing primer，用于制备测序反应模板的PCR扩增和焦磷酸测序反应，序列见表2。其中Biotin-为生物素标记修饰。引物来自上海生工生物工程技术服务有限公司，普通引物纯化级别为HAP级，生物素标记引物纯化级别为HPLC级，测序引物纯化级别为ULTRAPAGE级。

表2　SNP位点类型及焦磷酸测序引物序列

PCR扩增采用50 μL反应体系，其中10×Taqbuffer 5 μL，25 mmol/L Mg2+5 μL，10 mmol/L dNTP mix 1 μL，上下游引物(浓度为10 μmol/L)各1 μL，DNA 模板2 μL(质量浓度为90 mg/L)，5 U/μLTaqPloymerase 1 μL ，双蒸水补足50 μL。

反应程序为94 ℃预变性5 min，50个循环反应(94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s)，72 ℃延伸 5 min，4 ℃保存。

焦磷酸测序反应在PyroMark ID 焦磷酸测序仪(Qiagen)上进行。配置Binding buffer(40 μL)和Sepharoe beads(2 μL)的Mix 80 μL体系，加入30 μL PCR产物，1 300 r/min涡旋混匀15 min，使得beads与生物素结合；经Vacuum prep workstation单链分离，释放到预先加入38 μL Annealing buffer和2 μL测序引物(10 μmol/L)的PSQ 96测序反应板中，80 ℃金属加热块(Labnet)上加热2～5 min 后冷却至室温。将酶、底物和A、T、C、G成分加入试剂仓，即可上机测序。测序结果可通过分型分析模式(Genotyping)直接获得样品SNP类型。

1.6数据分析

对SNP位点的等位基因频率、基因型频率数据进行统计分析，多态信息量PIC值使用PIC_CALC 软件计算。

1.7SSR标记纯度检测

PCR反应体系：1 ×TaqBuffer，1.5 mmol/L MgCl2，200 μmol/L dNTPs，引物各 0.2 μmol/L， 模板 DNA 30 ng，0.5 UTaqDNA Polymerase，总反应体系为10 μL，其余用ddH2O补齐。引物序列为： SSR14268-F:AAAGCATGGAAGCAAAGCAC；SSR14268-R:ACAGAATGGACCAACGGAAT；SSR 01784-F:AGCACTGAGACGAATTATGCC；SSR 01784-R:AGTGCAGGCTTGTTGGTTCT。

扩增程序为:94 ℃预变性 5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，33 个循环；72 ℃ 5 min。扩增产物在80 g/L 非变性聚丙烯酰胺凝胶分离，电泳缓冲液为0. 5 ×TBE，250 V恒电压电泳分离1.5 h，电泳后银染显色，统计带型。

2结果与分析

2.142个候选位点HRM扫描分析

分别用42对引物对71个黄瓜品种试验材料进行PCR扩增及HRM扫描分析。通过标准视图(图1-A)和差异视图(图1-B)显示，71个黄瓜品种中含有候选SNP位点的3种变异类型。

图1　Chr0303位点(左)和Chr0501位点(右)HRM分析结果

2.2焦磷酸测序技术检测SNP位点

根据HRM扫描结果，对14个候选SNP位点的不同碱基变异类型进行PCR扩增和焦磷酸测序，确认SNP分型类型。测序结果显示，不同SNP分型的碱基序列不同，与预期序列相符(图2)，且结果与HRM筛选结果中变异类型分组相一致。

2.3SNP筛选群体分型结果

根据HRM分组结果及测序验证结果，进行14个位点的SNP分型鉴定。对14个位点在71个市售黄瓜品种材料中的等位基因频率、基因型频率和多态信息量进行分析，结果显示(表3)：Chr0303位点的PIC值高达0.528，处于高度多态；Chr0108、Chr0203、Chr0206、Chr0501、Chr0505和Chr0602位点的PIC值处于中度多态。

图2　Chr0303位点(左)和Chr0501位点(右)焦磷酸测序验证

位点Site等位基因频率Allelefreq.类型Type频率Frequency基因型频率Genotypefreq.类型Type频率Frequency多态信息量PIC群体分型Genotypeingroup杂交种Hybrid母本Maternalparent父本PaternalparentChr0102C76(0.543)C/C6(0.085)0.169C/TC/CC/TT64(0.457)C/T64(0.901)T/T1(0.014)Chr0108C98(0.721)C/C40(0.588)0.496C/TT/TC/CT38(0.279)C/T18(0.265)T/T10(0.147)Chr0203C19(0.134)C/C7(0.099)0.274C/TT/TT/TT123(0.866)C/T5(0.070)T/T59(0.831)

(续表3Continued table 3)

位点Site等位基因频率Allelefreq.类型Type频率Frequency基因型频率Genotypefreq.类型Type频率Frequency多态信息量PIC群体分型Genotypeingroup杂交种Hybrid母本Maternalparent父本PaternalparentChr0206C123(0.866)C/C57(0.803)0.307C/TT/TC/CT19(0.134)C/T9(0.127)T/T5(0.070)Chr0302C137(0.965)C/C66(0.930)0.122C/TC/CC/CT5(0.035)C/T5(0.070)T/T0Chr0303T96(0.676)T/T39(0.549)0.528T/CC/CT/TC46(0.324)T/C18(0.254)C/C14(0.197)Chr0407A4(0.028)G/G68(0.958)0.079A/GA/AG/GG138(0.972)A/G2(0.028)A/A1(0.014)Chr0408G121(0.852)G/G60(0.845)0.237G/AA/AG/GA21(0.148)G/A1(0.014)A/A10(0.141)Chr0501A118(0.831)A/A54(0.761)0.358A/CC/CA/AC24(0.169)A/C10(0.141)C/C7(0.099)Chr0505C35(0.273)T/T39(0.609)0.487C/TC/CT/TT93(0.727)C/T15(0.234)C/C10(0.156)Chr0602A103(0.725)A/A42(0.592)0.492A/GG/GA/AG39(0.275)A/G19(0.268)G/G10(0.141)Chr0608G134(0.944)G/G65(0.915)0.150G/TT/TG/GT8(0.056)G/T4(0.056)T/T2(0.028)Chr0701G9(0.065)G/G2(0.029)0.176G/AA/AA/AA129(0.935)G/A5(0.072)A/A62(0.899)Chr0706C133(0.937)C/C66(0.930)0.126C/TT/TC/CT9(0.063)C/T1(0.014)T/T4(0.056)

注:PIC>0.5 为高度多态, 0.25

Note：PIC >0.5, highly polymorphic; 0.25

2.4验证可用于鉴定种子纯度的SNP标记

以单粒黄瓜种子为检测对象，进行萌发、DNA提取、PCR扩增及焦磷酸测序分型分析。如果分型结果为杂合型，则该粒种子为杂交种；如果为纯合型，则该粒种子为来自亲本的污染。供试品种的种子纯度为杂合型种子数量占总测试种子的百分比[5]。 用于黄瓜杂交种种子纯度鉴定的检测样品为上海交通大学黄瓜育种实验室提供的母本S1000，父本S1002，以及94个杂交种种子DNA(图3)。选取PIC值处于中度多态以上的7个SNP位点，筛查亲本的分型情况，挑选父母本分型不同且均纯合的SNP位点，最终筛选出6个SNP位点可用于黄瓜杂交种种子纯度鉴定，分别为Chr0108、Chr0206、Chr0303、Chr0501、Chr0505和Chr0602。以上述6个位点为分析对象，进行焦磷酸测序分型分析,结果显示，94株均为杂合型，计算该杂交一代的纯度为100.0%(图4)。同时，均以父母本为对照,得到6个SNP位点检测结果一致。

图3　黄瓜杂交种种子纯度鉴定材料

H11为母本SNP分型H11 is the genotype of maternal parent；H12为父本SNP分型H12 is the genotype of paternal parent；其余为杂交种SNP分型Others are the genotype of hybrid

图4 Chr0108位点(左)和Chr0602位点(右)群体验证SNP分型

Fig.4The genotype results in group for Chr0108(left) and Chr0602 (right) SNP sites

为了证明结果的准确性，利用SSR标记检测方法，从1号染色体和6号染色体上随机选取SSR引物36对，筛选出8个多态性标记，利用多态性标记对供试杂交种父母本、杂交种种子纯度进行鉴定，检测结果(图5)与SNP检测结果一致，可以说明这6个SNP位点适用于该品种的纯度鉴定。

图为1号染色体上的SSR标记：SSR14268SSR marker on chr1,SSR14268；P1为母本S1000P1 as female parent S1000；P2为父本S1002P2 as male parent S1002

图5 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测F1代种子纯度电泳图

Fig.5Polyacrylamide gel electrophoresis

for detecting F1seed purity

3讨 论

随着高通量测序技术的发展，大量的EST、SNP数据提交至相关数据库。SNP标记作为第3代分子标记，具有其他标记技术无法比拟的优势：分布密度高，SNP是目前为止分布最为广泛、存在数量最多的一种多态性类型，其标记密度比SSR标记更高；与功能基因的关联度高，更容易开发到性状相关的SNP功能标记；遗传稳定性强，SNP是基于单核苷酸的突变，其突变率低，一般仅为10-9，具有极高的遗传稳定性；检测通量高，易实现自动化分析。SNP标记一般只有2种等位基因型，数据统计简单，且不依赖检测平台，容易实现不同来源数据的整合和标准化。因此，SNP 标记技术以其高密度及双等位基因标记等特点已成为当前种子纯度和品种鉴定的发展趋势。

HRM 扫描分析以其快速、高通量、低成本的优势成为当今SNP等碱基变异筛选分析的首选技术[11]。Wim 等[4]通过直接测序和数据库(ICUGI)查询方法筛选甜瓜EST-SNP标记，平均每412 bp中含有1个SNP，建立了葫芦科作物中第1个包含SNP标记的遗传图谱，并以45个SNP位点对48个甜瓜品种进行区分。兰青阔等[5]建立了基于CLA6位点的黄瓜杂交种纯度鉴定方法，并用该方法检测出黄瓜杂交种‘优一’种子的纯度，该方法精确、快速、高通量且高度自动化，但是为确保结果的可靠性和准确性，应同时对供试样品的多个SNP位点进行检测分析。

本试验通过测序比对和查询NCBI、CuGenDB数据库等方法从黄瓜7条染色体上获得42个候选SNP 位点，利用新型的Qiagen real-time PCR system进行HRM 研究，在试验中充分体现了HRM 技术快速、低成本、操作方便和闭管检测防止污染等优势。结合HRM扫描分析和Pyrosequencing分型分析，以71个市售黄瓜品种为材料，筛选出14个SNP检测位点。为验证SNP检测位点的有效性和可行性，选取7个多态性较高的SNP位点为对象，以黄瓜杂交种种子的94份DNA和父母本DNA为模板，进行种子纯度鉴定。结果显示，基于6个SNP位点的Pyrosequencing检测结果完全一致，纯度都达到100%，初步可以说明其适用于该品种的纯度检测。为进一步鉴定结果的准确性，利用SSR标记对供试材料进行检测，发现结果与SNP标记检测结果一致。研究证明，对供试样品的6个SNP位点同时进行检测的黄瓜品种纯度鉴定方法，更加准确和可靠，具备用于品种鉴定的潜能，为丰富黄瓜遗传图谱及相关功能基因研究奠定基础。

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Received 2015-06-11Returned2015-08-10

Foundation item“12th Five-year Plan” National 863 Modern Agricultural Technology Projects (No. 2012AA100101); the Key Sci-tech Projects of Shanghai Municipal Science and Technology Commission (No.12391901500).

First authorYAO Danqing, female,master,agronomists.Research area:molecular plant breeding and seed quality inspection. E-mail:ydq_726@163.com

(责任编辑：潘学燕Responsible editor:PAN Xueyan)

Highly Efficient Identification of Seed Purity of Cucumber Hybrid by SNP Marker

YAO Danqing1, ZHU Wenying2, ZHANG Weiwei3, LOU Jianfeng1and PAN Junsong2

(1.Shanghai Seed Management Station，Shanghai201103，China； 2.School of Agriculture & Biology，Shanghai Jiaotong University，Shanghai200240，China；3.Shanghai Vocational College of Agriculture and Forestry，Shanghai201699，China)

AbstractTo test the purity of hybrid of cucumber(Cucumis sativus L.), 14 SNP site was screened by high resolution melting(HRM) and pyrosequencing technology from 71 commercial cucumber cultivars, of which polymorphism information (PIC) were 0.079-0.528.To verify the accuracy of the results in purity test, 94 F1 hybrid seeds were screened and identified using 6 SNP markers. The result showed that the seed purity was 100%，which was consistent with the results identified by SSR method overall, 6 SNP markers for identification of purity in testing samples can be more reliable, accurate, and efficient method, and can be used in DUS testing, which laid the foundation of cucurbit crops variety examination and protection of new varieties for the future.

Key wordsCucumber；Seed purity；Single nucleotide polymorphism(SNP)；High resolution melting(HRM)；Pyrosequencing technology

收稿日期：2015-06-11修回日期：2015-08-10

基金项目：“十二五”国家863 现代农业技术领域项目(2012AA100101)；上海市科委重点科技攻关项目(12391901500)。

中图分类号S642

文献标志码A

文章编号1004-1389(2016)04-0595-10

网络出版日期：2016-04-02

网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20160402.1118.032.html

第一作者：姚丹青，女，硕士研究生，农艺师，研究方向为分子植物育种与种子质量检验。E-mail:ydq_726@163.com