TAPHS1基因序列多态性与小麦生殖发育稳定性的相关分析

简俊涛,王宇娟,宋晓朋,连俊方,周丽敏,安旭尧,孙道杰

(1.西北农林科技大学 农学院，陕西杨凌　712100;2.杨凌区种子站，陕西杨凌　712100)



TAPHS1基因序列多态性与小麦生殖发育稳定性的相关分析

简俊涛1,王宇娟2,宋晓朋1,连俊方1,周丽敏1,安旭尧1,孙道杰1

(1.西北农林科技大学 农学院，陕西杨凌712100;2.杨凌区种子站，陕西杨凌712100)

摘要TAPHS1基因是MFT-like基因，可调控小麦成熟期的籽粒休眠(影响穗发芽抗性)且与开花的发育控制相关，位于小麦3A染色体短臂上。为探究该基因序列多态性与小麦生殖发育稳定性的关系，设计PCR引物扩增 TAPHS1基因的2个高频变异区，获得86个品种相应基因区段的DNA序列信息；以不同播期之间抽穗期相差时间为指标调查评价各品种的生殖发育稳定性。结果表明：在 TAPHS1基因的高频变异区存在5种多态性，将其命名为A类、B类、C类、D类、E类；A类、B类、C类属非编码区多态性，D类及E类同时涉及编码区和非编码区多态性；D类及E类序列多态性与生殖发育稳定性相关，并根据D类序列信息开发了分子标记。

关键词TAPHS1基因；小麦；序列多态性；生殖发育稳定性

TAPHS1基因在小麦中是MFT-like基因，位于3A染色体短臂上，研究表明该基因在小麦中具有调控穗发芽的功能，然而在模式植物拟南芥中TAMFT基因具有调控开花时间的功能[1]。MFT基因属于MFT-like亚家族且是FT和TFL1的同源物，FT能够促进开花，然而TFL1延迟开花，它们对开花起相反的调控作用[2-3]。MFT-like属PEBP家族基因，在植物中PEBP家族基因编码的蛋白与磷酸乙醇胺结合蛋白/激酶抑制剂蛋白(phosphatidylethanolamine-binding protein，PEBP/Raf kinase inhibitor protein，RKIP)非常相似，都含有保守的PEBP/RKIP结构域，在编码区占有较大的比重[4-5]。在拟南芥中，MFT通过激素ABA及GA信号途径调控种子发芽，MFT功能缺失的拟南芥在种子发芽期表现出对ABA高度敏感性，也有研究表明MFT在拟南芥中决定开花时间，在长日照下MFT正常表达使开花时间稍微提前，其作为开花诱导物对成花诱导起到冗余的功能[6-7]。在石斛中MFT调控生殖生长，过量表达导致开花期推迟[8]，然而海岛棉中MFT在花瓣中的表达量较高且该基因的表达不受ABA的调控[9]。小麦中MFT具有调控种子休眠的作用，高温对MFT的转录物起上调作用，低温及种子储存时间对此起下调作用[10-11]。

世界40%以上人口以小麦为主食，小麦为人类提供超过20%的蛋白和能量[12]。近年来随着气候变暖，温度的不断升高已经影响作物生产的稳定性[13-14]。在不同年份，降雨、暖冬、倒春寒等导致许多推广的小麦品种抽穗期、开花期以及成熟期发生比较大的波动，造成籽粒瘪瘦[15]，从而减产。植物完成一定的营养生长后向生殖生长的转变对植物保障物种稳定性及适应周边的生存环境非常重要，由营养生长向生殖生长的转变这一过程受多种因素的调控：光周期、春化、激素、发育阶段基因内调控[16-17]，这些因素组成一个调控网络响应环境因子，进而调控开花[18-19]。从进化角度看，植物的抽穗期稳定性直接与适应性相关，可以作为适应环境的一个特征[20]。植物由营养生长向生殖生长的转变是植物能否开花的关键环节。一般植物从营养生长向生殖生长的转变是对环境的高度适应及其内在遗传因子对发育阶段的精确调控[21]。小麦的成熟与抽穗具有高度相关性，对于成熟期，抽穗期更易于观察和记载，一般研究小麦生育期常以抽穗期为指标。

田间调查发现，当前推广的许多小麦品种在不同年份抽穗期、开花期具有较大的波动性，但有些品种抽穗期和开花期却非常稳定。小麦的抽穗及开花受春化基因、光周期基因及早熟性基因影响，研究表明隐性春化基因能够维持小麦生殖发育稳定性，而光周期基因对生殖发育稳定性的影响不显著[22]。本研究尝试从与抽穗开花密切相关的 TAPHS1基因着手，利用已搜集的国内各大麦区主栽小麦品种366份为材料，在不同材料中克隆测序 TAPHS1基因的高频变异区，探究该基因的序列多态性，采用分期播种法，2种播期相差40 d，以2种播期下抽穗期差值作为生殖发育稳定性的评价指标，进行生殖发育稳定性与 TAPHS1基因序列多态性关联性分析，从而确定哪些序列信息与生殖发育稳定性相关，以期探究 TAPHS1基因对小麦生殖发育的影响，针对 TAPHS1基因多态性中维持发育稳定性的多态性设计引物，从而为生殖发育稳定性品种的选育提供分子参考。

1材料与方法

1.1田间种植与管理

以国内各大麦区主栽小麦品种366份为材料，于2011-2013年种植于西北农林科技大学北校区试验田和河南荥阳试验田，第1播期在每年10月初种植，采用分期播种法，播期相差40 d，采用随机区组设计，每个材料种植2行，行长1 m，行距0.25 m，株距0.02 m。冬前及冬后田间调查苗相并结合生长过程中的实际表型综合判定冬春性，每年3月底开始调查抽穗期。

1.2DNA提取及 TAPHS1基因的克隆、序列分析

在小麦五叶期取材并采用CTAB法提取小麦叶片的基因组DNA。基于小麦TAMFT基因及 TAPHS1基因的高频变异区，采用Primer 5.0设计引物MFT-F2170/MFT-R2605(MFT-F2170: GCTGCAGGTGATGACGGAT；MFT-R2605: TGAGAGACACGCAAGAACGAT)，并在Oligo 7.0中进行评价。

根据TakaRaTaq聚合酶使用说明建立30 μL体系，对PCR产物进行12 g/L琼脂糖电泳并回收纯化，使用PMD18-T载体进行连接转化，4 ℃过夜后转化制备的感受态细胞DH5α。每个材料挑取12个菌落置于2.0 mL装有LB液体培养基的离心管，在37 ℃、200 r/min培养12 h，对菌落进行PCR检测后送上海生工生物技术服务有限公司进行测序，重复测序3次。使用MegAlign、DNAMAN 6.0软件及NCBI(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库的BLAST程序对测序结果进行分析。

1.3 TAPHS1基因不同多态性对应抽穗期差异的计算方法

不同多态性抽穗期差异= 两地同年该多态性品种分期播种后抽穗期相差时间的和 /(2×该多态性小麦品种数量)

1.4多态性与抽穗期差异的相关分析

采用Microsoft office excel 2007对分期播种下两年两地田间调查的小麦抽穗期进行整理，统计各品种的多态性类型，用Dpsv 7.05软件对 TAPHS1基因多态性与抽穗期相差时间进行相关分析。

2结果与分析

2.1 TAPHS1基因各多态性所含品种数量及抽穗期差值的分布情况

完成克隆测序的小麦品种共86个，统计发现 TAPHS1基因包含5种多态性，将其命名为A类、B类、C类、D类、E类。在5种多态性中A类材料最多占36.05%，随后依次是E类占31.39%、D类占19.77%、C类占8.14%、B类占4.65%。D类及E类多态性材料抽穗期差值总体集中且偏小，A类多态性材料抽穗期差值分布比较分散且抽穗期差值总体较大。

2.2 TAPHS1基因多态性与抽穗期差值的相关分析

如表1所示，对 TAPHS1基因多态性与采用分期播种下抽穗期差值进行相关分析后发现，D类及E类多态性使小麦具有稳定的抽穗期，抽穗期差值分别为4.53 d及5.05 d，相比其他3类多态性而言抽穗期差值均达显著水平；相比B类多态性而言，D类及E类抽穗期差值均达极显著水平。B类、C类、A类多态性使小麦具有不稳定的抽穗期。

2.3 TAPHS1基因序列差异分析

通过NCBI查询后发现(图1)，D类及E类多态性在第54位碱基处由碱基A突变为G，该碱基突变发生在编码区，查询密码子后，由A-G的突变导致编码的赖氨酸(Lys)变为精氨酸(Arg)。在D类多态性中第115位点发生5倍TATG的重复插入，在第183～190位点伴随8个碱基的缺失；E类多态性在第314～316位点发生GT-AT导致编码区发生错误的剪切并在第334位点发生A-T的碱基突变，提前产生一个终止密码子从而缩短非功能性转录。其他位点碱基的替换、缺失、插入等均发生在非编码区。

表1　 TAPHS1基因多态性与抽穗期差值的相关性分析

注：同列数值后不同的大、小写字母分别表示多态性间差异极显著(P<0.01)和显著(P<0.05)。

Note：The different capital or lowercase letters in the same column indicate differences in polymorphism significant at the 0.01 and 0.05 levels,respectively.

CK.txt表示中国春的MFT基因序列，(A、B、C、D、E).txt分别为 TAPHS1基因的5种多态性。图中相同颜色区域表示碱基相同，不同颜色区域表示多态性位点。

CK.txt represents sequence ofMFTgene in Chinese spring,(A、B、C、D、E).txt represent five kinds of polymorphism in the areas of TAPHS1 gene.The same color area in the figure bases are the same,while different color areas represent polymorphic loci.

图1 TAPHS1基因序列差异分析

Fig.1 Analysis of TAPHS1 gene sequence difference

2.4 TAPHS1基因D类多态性的分子检测及其对小麦生殖发育功能的验证

针对D类多态性设计2对引物用于D类多态性材料的检测，第1对引物F-2SJ/R-SRP2605(F-2SJ：AATTCCATAGATCTCCACACA ；R-SRP2605：TGAGAGACACGCAAG AACGAT)，第2对引物F-2242/R-SRP2605(F-2242：TGT- ACTACTACTGCTGCTGCT；R-SRP2605：TG- AGAGACACGCAAGAACGAT)。如图2所示，利用聚丙烯酰胺凝胶电泳，均能够将D类多态性和其他4类多态性区分开，其中使用第1对引物扩增的结果是：D类多态性材料的目的片段比其他多态性材料的目的片段小8 bp或10 bp；第2对引物扩增的结果是：在D类材料中目的片段比其他多态性材料的目的片段大8 bp或10 bp或14 bp。

M表示梯度为100 bp的MakerM represented 100 bp DNA ladder；使用第1对引物：1～4表示在D类多态性材料中扩增片段大小为278 bp，5～8表示在其他4种多态性材料(A类、B类、C类、E类)中扩增的片段Using the first pair of primers: 1-4 represented amplified fragment size of 278 bp in polymorphism of type D,5-8 represented amplified fragment size in polymorphism of type A,type B,type C and type E；使用第2对引物：9～12表示在D类多态性材料中扩增片段大小为374 bp，13～16表示在其他4种多态性材料(A类、B类、C类、E类)中扩增的片段Using the second pair of primers: 9-12 represented amplified fragment size of 374 bp in polymorphism of type D,13-16 represented amplified fragment size in polymorphism of type A,type B,type C and type E

图2 TAPHS1基因D类多态性的分子检测

Fig.2Molecular detection of TAPHS1 gene polymorphism of type D

利用开发的2对标记检测288份国内各大麦区主栽小麦品种，检测到53份D类多态性材料，非D类多态性材料235份。将D类和非D类材料与抽穗期差值进行相关性分析，抽穗期差值均值分别为4.51 d 、6.08 d，D类多态性与非D类多态性材料之间差异显著(P=0.040 7)，D类多态性能够使小麦具有稳定的生殖发育特性。由图3可知，对D类和非D类材料抽穗期差值分布进行统计，D类多态性的小麦品种抽穗期差值较小且比较集中，非D类多态性材料抽穗期差值总体较大且较分散，针对D类多态性材料抽穗期差值较大的小麦品种进行分析，发现这些品种为春性或者偏春性，可能春化基因影响这些小麦的生殖发育特性。

图3　 TAPHS1基因D类多态性对

3讨 论

小麦由营养生长向生殖生长的转变受春化基因、光周期基因、早熟性基因及其他开花相关基因的调控。春化基因、光周期基因及早熟性基因对小麦发育的影响均有较深的研究[23-25]。MFT基因在不同植物中与抽穗及开花相关，在小麦中MFT基因的同源基因 TAPHS1基因具有调控穗发芽的功能。本试验探索 TAPHS1基因的序列多态性并研究这些多态性和小麦生殖发育的相关性。完成测序的86份国内小麦品种中发现5类多态性，D类和E类多态性能够使小麦具有稳定的生殖发育特性。D类和E类多态性在编码区发生碱基A-G的突变导致编码赖氨酸变为精氨酸，编码区单个碱基的突变造成编码氨基酸的改变，可能影响蛋白质结构的变化，这是否影响小麦生殖发育稳定性还需进一步探究；D类多态性相比E类多态性而言能够在较大程度上维持小麦生殖发育的稳定性，相比E类多态性而言D类多态性非编码区发生5倍TATG的碱基插入并伴随连续8个碱基的缺失，非编码区对编码区的调控作用可能是该类多态性维持生殖发育稳定性的原因。通过NCBI对设计的2对引物进行查询并比对发现，D类多态性序列和小麦 MFT-A1a基因序列一致(登录号：KF311059.1)，有研究表明该基因的转录水平受到高温的上调作用，该基因可能对小麦种子休眠机制具有一定的调控作用，E类多态性序列和 TAPHS1基因序列一致，该类多态性可能对种子休眠、穗发芽、生殖发育稳定性等均有一定的功能。

小麦生殖发育稳定性可能受多个基因的影响，尽管D类多态性能使小麦具有稳定的生殖发育特性，但D类多态性中也有个别生殖发育不稳定的品种，针对D类多态性中生殖发育不稳定的品种进一步研究发现，这些品种均为春性或者偏春性，可能陕西杨凌和河南荥阳并不是春性及偏春性品种最佳种植区域，此外这些生殖发育不稳定的品种还可能受到春化及光周期基因的影响。本试验材料种植地陕西杨凌及河南荥阳均为黄淮麦区，2个种植地具有不同的降水、光照等环境因子，对于本试验的研究具有代表性，然而本研究所用材料有限，所得结论的科学性尚需在更多材料中去验证。总之，小麦生殖发育稳定性受春化基因、光周期基因、早熟性基因、抽穗及开花其他相关基因的调控，生殖发育稳定性相关基因的发掘对生殖发育稳定性品种的选育非常重要。选育生殖发育稳定性的品种能够应对当前及今后气候的变暖导致的连阴雨、干旱、暖冬、倒春寒的危害，不因环境的变化而导致抽穗期及开花期提前或延后从而减少病虫害的发生或加重几率，生殖发育稳定性的品种在不同年度间维持稳定的抽穗期能够使小麦保证完整的生育期并获得丰收。

4结 论

小麦 TAPHS1基因编码区及非编码区在不同品种间具有序列多态性；在编码区发生的单个碱基突变导致编码氨基酸的改变可能影响该基因对生殖发育稳定性的功能，非编码区碱基的插入及缺失可能对编码区具有一定的调控作用，从而影响生殖发育特性；除该基因外，春化基因、光周期基因、早熟基因及其他抽穗开花相关基因也可能调控小麦的生殖发育特性。

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Received 2015-03-31Returned2015-04-29

Foundation itemNational Program of China (No.2014CB138100,No.2012AA101105); Projects of International Cooperation(No.2012DFA32290); Shaanxi Innovative Research Team for Key Science and Technology (No.2014KCT-25) .

First authorJIAN Juntao,male,master.Research area:crop genetic breeding.E-mail：jjt312024501@163.com

(责任编辑：成敏Responsible editor:CHENG Min)

Correlation Analysis between Polymorphism of TAPHS1 Gene Sequence and Reproductive Stability of Wheat

JIAN Juntao1,WANG Yujuan2,SONG Xiaopeng1,LIAN Junfang1,ZHOU Limin1,AN Xuyao1and SUN Daojie1

(1.College of Agronomy,Northwest A&F University,Yangling Shaanxi712100,China；2.Yangling Seed Station,Yangling Shaanxi712100,China)

AbstractTAPHS1 gene,also called MFT-like gene,which could regulate and control wheat grain dormancy,affected harvest sprouting resistance,and was also related to flowering developmental control,existed in the short arm of 3A chromosome in the wheat.In order to explore the correlation between polymorphism of TAPHS1 gene sequence and reproductive stability of wheat,this study,by designing PCR primers to amplify two hypermutation areas of TAPHS1 gene,obtained DNA sequence information of corresponding gene segments in 86 varieties of wheat.Number of day discrepancy of heading stage,which was based on different sowing periods,was adopted as the index to survey and assess reproductive stability of different varieties.The results showed that,there are five kinds of polymorphism in the hypermutation areas of TAPHS1 gene,named as type A,type B,type C,type D,and type E.Type A,B,and C belong to noncoding region polymorphism,while type D and E involve both coding and noncoding region polymorphism.Polymorphism of type D and E is closely related to reproductive stability.The molecular markers were made based on sequence information of type D.

Key wordsTAPHS1 genes; Wheat; Polymorphism of gene sequence; Reproductive stability

收稿日期：2015-03-31修回日期：2015-04-29

基金项目：国家计划项目(2014CB138100，2012AA101105)；国际科技合作专项(2012DFA32290)；陕西省重点科技创新团队(2014KCT-25)。

通信作者：孙道杰,男,副研究员,博士,主要从事作物遗传育种研究。 E-mail：chinawheat@hotmail.com

中图分类号S512.1；S330

文献标志码A

文章编号1004-1389(2016)04-0523-07

Corresponding authorSUN Daojie,male,associate researcher,Ph.D.Research area:crop genetic breeding.E-mail：chinawheat@hotmail.com

网络出版日期：2016-04-02

网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20160402.1111.014.html

第一作者：简俊涛,男,在读硕士,从事作物遗传育种研究。E-mail：jjt312024501@163.com