长期慢性低氧对牦牛和黄牛血液中HIF-2α、EPO水平及红细胞相关指标的影响

刘凤云，李愈娴，胡　琳，刘世明，祁生贵，杨　蕾，唐永平，吴天一

(青海省高原医学科学研究院，科技部高原医学研究重点实验室培育基地，西宁　810012)



长期慢性低氧对牦牛和黄牛血液中HIF-2α、EPO水平及红细胞相关指标的影响

刘凤云，李愈娴，胡琳，刘世明，祁生贵，杨蕾，唐永平，吴天一

(青海省高原医学科学研究院，科技部高原医学研究重点实验室培育基地，西宁810012)

摘要为探讨牦牛和迁饲黄牛血液中红细胞(RBC)、血红蛋白(HB)、低氧诱导因子-2α(HIF-2α)、促红细胞生成素(EPO)等因子对高原适应和习服的不同特征及调控机理，按照海拔低于3 500 m和高于3 500 m 两组采集青海地区的牦牛血样，同时采集高山迁饲黄牛(海拔2 500 m)及低海拔黄牛(海拔1 300 m)血液，采用全自动血液分析仪测定血液中红细胞、血红蛋白、红细胞比容(HCT)、平均红细胞血红蛋白量(MCH)等；采用双抗夹心酶标法测血液中EPO、HIF-2α含量。通过t检验及单因素方差分析法分析指标间的差异性，并分析各指标与HIF-2α、EPO的相关性。结果表明，海拔高于3 500 m牦牛组的RBC、HB、 HCT显著升高，而HIF-2α和EPO水平却未发生显著变化。与迁饲黄牛和低海拔黄牛相比，牦牛血液中的RBC明显降低，而MCH、HIF-2α和EPO显著升高。牦牛血液中EPO、RBC、HB、HCT、MCH水平与HIF-2α水平呈显著相关；迁饲黄牛血液中红细胞分布宽度(RDW-SD)与EPO水平呈显著相关；低海拔黄牛血液EPO、MCH水平与HIF-2α水平呈显著相关。推测：海拔升高引起的低氧是影响牦牛血液RBC、HB、HCT改变的主要因素；与黄牛相比，低RBC、低MCH、高HIF-2α、高EPO水平是牦牛适应低氧的主要特征，且牦牛血细胞各指标对血液中HIF-2α水平的改变更敏感。提示牦牛通过遗传进化成功适应高原环境。

关键词慢性低氧；牦牛；高山迁饲黄牛；血细胞；HIF-2α；EPO

低氧(hypoxia)是影响青藏高原生命健康的重要因素。红细胞和血红蛋白在生物体内承担运输氧气的生理功能，对低氧条件下保证组织细胞的氧气供应及生物氧化有重要作用。促红细胞生成素(Erythropoietin，EPO)主要在幼红细胞未形成血红蛋白时促进红系增殖。有研究表明，低氧时，低氧诱导因子-2α(Hypoxia-inducible factor-2a，HIF-2α)是EPO生成的主要调控者[1-2]，与高原世居者和土生动物适应高原、维持低血红蛋白浓度密切相关[3]。有关长期慢性低氧时牦牛血细胞适应特征的研究多有报道[4-7]，但不同海拔时红细胞各参数水平与血液中HIF-2α和EPO水平的相关性尚不清楚。迁饲至高海拔的黄牛与牦牛均面临低氧的挑战，在习服高原的过程中高海拔黄牛血细胞与低海拔黄牛相比发生了哪些变化？此改变是否与高原适应的牦牛具有趋同性？与HIF-2α、EPO水平相关性如何？这些均未见报道。因此，本研究对长期慢性低氧时牦牛和黄牛血液中HIF-2α、EPO水平及红细胞、血红蛋白的相关生理指标进行分析，以探讨牦牛对高原的适应(Adaptation)和平原迁饲高原黄牛的习服(Acclimatization)间的生物学特征及其相关性。这对高原人类适应及生物低氧进化也有借鉴意义。

1材料与方法

1.1动物与分组

牦牛组：按产地海拔不同，分低于3 500 m牦牛组及高于3 500 m牦牛组；高山迁饲黄牛组：为20世纪70年代末从山东引进的西门塔尔牛与当地黄牛的杂交品种，迁饲地海拔2 500 m；低海拔黄牛组：为甘肃省平凉市饲养的当地秦川牛，饲养地海拔1 300 m。 3种牛均为4～6岁的雄性牛。

1.2检测方法与指标

牛颈动脉放血处死时收集血液，置于肝素抗凝管中于3 000 r/min离心10 min后吸出上清液，采用日本Sysmex公司生产的全自动血液分析仪(型号Sysmex XT-1800i)进行红细胞计数(Red blood cell count，RBC)、血红蛋白测定(Hemoglobin，HB)、红细胞比容(Hematocrit， HCT)、平均红细胞体积(Mean corpuscular volume，MCV)、平均红细胞血红蛋白量(Average red blood cell hemoglobin content，MCH)、红细胞分布宽度-CV[Red blood cell distribution width (CV)，RDW-CV]、红细胞分布宽度-SD[Red blood cell distribution width(SD)，RDW-SD]等与红细胞相关的指标测定；采用双抗体夹心法测定牛血标本中HIF-2α和EPO水平。ELISA试剂盒为上海将来实业有限公司产品，抗体均为兔多抗，采用美国BIO-RAD公司生产的EVOLIS全自动酶免分析系统进行检测。

1.3数据处理

采用SPSS17.0软件分析数据，其中，组间比较采用独立样本t检验及单因素方差分析，相关性检验采用双侧Pearson相关性检验。数据以“平均数±标准差”表示。

2结果与分析

2.1不同海拔牦牛血液中血细胞相关指标及HIF-2α和EPO的变化

独立样本t检验分析结果显示(表1)，与生活在较低海拔的牦牛相比，生活在极高海拔牦牛的RBC、HB、 HCT及 RDW-CV 4项指标显著升高， 且差异极显著(P<0.01)，其他指标间无显著性差异(P>0.05)。

表1　不同海拔牦牛血液中血细胞相关指标及HIF-2α和EPO的变化

注：RBC. 红细胞计数；HB. 血红蛋白；HCT. 红细胞比容；MCV. 平均红细胞体积；MCH. 平均红细胞血红蛋白量；RDW-CV. 红细胞分布宽度(CV)；RDW-SD. 红细胞分布宽度(SD)；HIF-2α. 低氧诱导因子-2a；EPO. 促红细胞生成素。**表示与海拔低于3 500 m牦牛组比较，P<0.01。下同。

Note：RBC. Red blood cell count; HB. Hemoglobin; HCT. Hematocrit; MCV. Mean corpuscular volume; MCH. Average red blood cell hemoglobin content; RDW-CV. Red blood cell distribution width(CV); RDW-SD. Red blood cell distribution width (SD); HIF-2α. Hypoxia-inducible factor-2a; EPO. Erythropoietin. **Blow 3 500 m yak group versus over 3 500 m yak group,P<0.01.The same below.

2.2牦牛、迁饲黄牛及低海拔黄牛血液中血细胞相关指标及HIF-2α和EPO的变化

单因素方差分析结果显示(表2)，牦牛血液中RBC、MCH、RDW-CV、HIF-2α、EPO与迁饲黄牛、低海拔黄牛有显著性差异，黄牛之间无显著性差异。其中，牦牛RBC、RDW-CV 显著低于迁饲黄牛和低海拔黄牛，MCH、HIF-2α、EPO显著高于迁饲黄牛和低海拔黄牛。

2.3牦牛、迁饲黄牛和低海拔黄牛血细胞指标与血液HIF-2α、EPO水平的相关性

双侧Pearson 相关性检验结果显示(表3～表5)，牦牛血液中RBC、HB、HCT、MCV、MCH及RDW-SD与血液中HIF-2α水平呈显著相关，与EPO水平无相关性，HIF-2α与EPO水平显著相关；迁饲黄牛血液中RBC、HB、HCT、MCV、MCH及RDW-SD与血液中HIF-2α无相关性，而RDW-SD与EPO水平呈显著相关，HIF-2α与EPO水平不相关；低海拔黄牛血液中RDW-CV和MCH与HIF-2α呈显著相关，其他血细胞指标均与HIF-2α和EPO水平不相关，HIF-2α与EPO水平呈显著相关。

表2　牦牛和黄牛血液中HIF-2α、EPO水平及红细胞相关指标变化

注：牦牛与黄牛比较，*P<0.05，**P<0.01。

Note：Yak versus cattle, *P<0.05, **P<0.01.

表3　牦牛血细胞指标与血液HIF-2α、EPO水平的相关性

注： * 在 0.05 水平(双侧)上显著相关。** 在 0.01 水平(双侧)上显著相关。下同。

Note：*significant correlation on 0.05 level; ** significant correlation on 0.01 level.The same below.

表4　迁饲黄牛血细胞指标与血液HIF-2α、EPO水平的相关性

表5　低海拔黄牛血细胞指标与血液HIF-2α、EPO水平的相关性

3讨 论

因高原世居人群和高原土生动物的生活环境和生活习性不同，其红细胞和血红蛋白存在相同(趋同进化)或不同(适应辐射)的适应特征。本研究结果表明，生活在青藏高原较高海拔牦牛血液中RBC、HB、HCT 及RDW-CV等均显著高于较低海拔牦牛。说明：随着海拔的增加，氧分压降低，牦牛血液中RBC、HB、HCT、RDW-CV会代偿性增加以满足机体对氧的需求。这与江家椿等[4]报道的生活在西藏那曲(海拔4 500 m)牦牛红细胞总数、红细胞压积、血液总量、血红蛋白均极明显高于较低海拔的藏南河谷(海拔3 000 m)牦牛的结果一致。Wu等[3]对3 500名居住在喜马拉雅高山居民(藏族、夏尔巴人和拉达克人)的平均血红蛋白浓度进行分析，结果显示，其平均血红蛋白浓度均低于移居喜马拉雅的低地居民(汉族、印度泰米尔人及前往珠穆朗玛峰探险的欧洲平原人)和安第斯山脉的高原居民 ，揭示青藏高原世居居民在高原适应上的生理特征。而有研究显示，高原鼠兔(Plateau pika，Ochotonacurizoniae)这一典型的高山土生动物是以低HCT、低HB为特征，不因海拔的变化而表现出明显的RBC的变化[8]。

与高山迁饲黄牛和低海拔黄牛相比，虽然牦牛血液中RBC水平显著低于黄牛，但其MCH显著高于黄牛。说明：牦牛不是通过增加RBC值而是通过提高红细胞的HB含量来适应高原，这样既防止红细胞增多导致血液粘稠度增高引发的循环功能障碍，又通过MCH的增高来携带更多的氧以满足长期缺氧环境中机体的需要，这是牦牛适应高原的一个重要的血液学特征。

红细胞体积分布宽度(RDW)是反映周围血循环血液中红细胞体积大小变异的参数，RDW增高提示红细胞生成障碍或红细胞破灭增加,在临床上多用于不同类型贫血的鉴别诊断,也可预测包括原发性肺动脉高压和慢性心脏衰竭在内的主要疾病的存活率[9-10]。牦牛血液中的RDW-CV值显著低于黄牛，而高原迁饲黄牛和低海拔黄牛间无显著差异。说明：长期慢性低氧时，牦牛血液中异常增生的红细胞或破灭的红细胞低于黄牛，这使得牦牛红细胞体积更为均一，更利于红细胞的变形以通过狭窄的毛细血管，这可能是牦牛适应高原的另一血液形态学特征，但尚需排除是否与牦牛和黄牛间的种属差异有关。

有研究发现，大多数低氧诱导基因的低氧诱导途径可通过HIF实现[11]，HIF-2α可主要调节EPO的生成[2]。分析高原土生牦牛和迁饲黄牛血液中HIF-2α和EPO的关系可以发现，随海拔高度增加，牦牛血液中HIF-2α和EPO的水平未显著性增加，而与迁饲至高海拔的黄牛和生活在低海拔的黄牛相比，牦牛血液中HIF-2α和EPO水平高出1.5～2.2倍。说明：一方面高原牦牛血液中EPO能有效调控低氧条件下红细胞的生成，另一方面又能有效地使RBC及HB值处于一个稳态水平，这是牦牛适应高原的一个重要特征，也是高原牦牛和平原迁饲黄牛的血细胞应对高原低氧反应的主要区别。相关性分析表明，牦牛血液中HIF-2α与EPO水平呈显著正相关。说明：尽管高原牦牛生活在低氧环境，但其血液中的HIF-2α与EPO已建立稳定的调控关系，与低海拔黄牛的相关性相似，这是高山土生动物最成功的遗传-进化适应(genetic adaptation)的生物学标志，然而处于习服水平的迁饲黄牛则不具备此特征。

牦牛的HIF-2α与RBC、HB、HCT、MCV、MCH、RDW-SD均呈显著正相关，与世居藏族居民血液中HIF-2α与HB呈正相关的报道一致[12]。说明：通过长期的自然选择，高原世居人群和高山土生动物在面临同样的高原低氧环境时具有相似的生理-生物学适应策略。低海拔黄牛的HIF-2α与MCH、RDW-CV呈显著相关，而高山迁饲黄牛的HIF-2α与检测的血细胞指标均无明显的相关性，仅RDW-SD与EPO呈显著负相关，可能反应牦牛血液学对HIF-2α的调控更为易感，血细胞的RBC、HB、HCT、MCV、MCH、RDW-SD随时随着HIF-2α的改变而改变，而迁饲黄牛尚处于高原习服状态，血细胞随HIF-2α变化而改变的紧密联系并未完全建立。有研究[13-15]认为，高原鼠兔适应低氧的模式是低代谢高应激的优秀模式，牦牛生存环境与高原鼠兔类似，这提示两者可能存在趋同性进化，具体还有待进一步研究。

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Received 2015-07-23Returned2015-11-27

Foundation itemThe “pre-973” National Basic Research Program(No.2012CB722506); “973” National Basic Research Program(No.2012CB518202).

First authorLIU Fengyun, female, research fellow. Research area:hypoxic physiology. E-mail:liiffyuu@163.com

(责任编辑：郭柏寿Responsible editor:GUO Baishou)

Effect of Altitude Chronic Hypoxia on HIF-2α, EPO and in Yak and Migrated Cattle on Qinghai-Tibetan Plateau

LIU Fengyun, LI Yuxian, HU Lin, LIU Shiming, QI Shenggui,YANG Lei, TANG Yongping and WU Tianyi

(National Key Laboratory of High Altitude Medicine, Qinghai High Altitude Medical Research Institute, Xining810012, China)

AbstractIn order to investigate the difference adaptive features of red blood cell's parameter and its correlation with serum HIF-2α and EPO between yak and migrated cattle on Qinghai-Tibetan plateau, the serum samples of yak were collected under 3 500 m and up 3 500 m respectively in Qinghai, meanwhile the serum samples of migrated cattle on plateau (2 500 m) and lowland cattle (1 300 m) were also collected. The levels of hematocrit (HCT), mean corpuscular volume (MCV), mean red blood cell hemoglobin content (MCH) etc. in serum were measured by using fully automatic hematology analyzer, and the levels of hypoxia inducible factor-2a ( HIF-2α) and erythropoietin (EPO) in serum were measured by using enzyme linked immunosorbent assay. We analyzed the differences of the above and its correlation with HIF-2α and EPO. We used one way analysis of variance (ANOVA) and independent-samples t-test. The results showed that the levels of RBC, HB, and HCT in >3 500 m group of yak increased significantly compared with other groups which live in <3 500 m. As compared to migrated cattle and lowland cattle, the serum level of RBC was decreased whereas the level of MCH, HIF-2α and EPO of yak were increased significantly, respectively. The levels of RBC, HB, HCT, and MCH were significantly correlated to levels of HIF-2α, and a high correlation between HIF-2α and EPO in yak. The levels of RDW-SD was only correlated to the serum EPO activities in migrated cattle, whereas it was showed there were correlations between MCH and HIF-2α and between HIF-2α and EPO in lowland cattle. These results indicated that hypoxic caused by altitude take a key role in the changes of RBC, HB, HCT and RDW-CV levels in mountainous yaks. Compared with the migrated cattle and lowland cattle, lower levels of RBC, MCH and RDW-CV, and higher levels of HIF - 2a and EPO were the characteristics of the yak to adapt to hypoxic environment of high altitude. The levels of RBC, HB, HCT, MCV, MCH and RDW-SD in serum of yak had more sensitive to the changes of HIF-2α. The results suggest that yaks are genetically and successfully adapted to high altitude.

Key wordsChronic hypoxia; Yak; Migrated cattle; Blood cells; HIF-2a; EPO

收稿日期：2015-07-23修回日期：2015-11-27

基金项目：科技部973前期资助项目(2012CB722506)；科技部973资助项目(2012CB518202)。

通信作者：吴天一，男，研究员，工程院院士，研究方向为低氧生理与高原病。E-mail:wutianyiqh@hotmail.com

中图分类号Q494

文献标志码A

文章编号1004-1389(2016)04-0490-06

Corresponding authorWU Tianyi, male, professor, Chinese academy of engineering. Research area:hypoxic physiology and mountain sickness. E-mail:wutianyiqh@hotmail.com

网络出版日期：2016-04-02

网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20160402.1111.004.html

第一作者：刘凤云，女，研究员，研究方向为低氧生理。E-mail:liiffyuu@163.com