电针不同穴位对功能性腹泻大鼠空肠SERT蛋白及SERTmRNA表达的影响

刘智斌　杨晓航　牛文民　王　渊　刘思洋　朱先伟　王　强　王卫刚

陕西中医药大学(咸阳 712046)



电针不同穴位对功能性腹泻大鼠空肠SERT蛋白及SERTmRNA表达的影响

刘智斌杨晓航牛文民王渊刘思洋△朱先伟王强王卫刚▲

陕西中医药大学(咸阳 712046)

摘要探讨电针不同穴位对功能性腹泻大鼠空肠黏膜SERT蛋白(5-羟色胺转运蛋白)及SERTmRNA表达的影响。方法：成年SD大鼠60只，随机分为正常组、模型组、电针1组(取双侧上巨虚)、电针2组(取双侧曲池)、电针3组(取双侧天枢)、电针4组(取双侧大肠俞)，每组10只。以番泻叶煎剂灌胃复制功能性腹泻大鼠模型，通过电针刺激干预，测定空肠黏膜SERT蛋白和SERTmRNA表达。结果：电针Ⅲ组空肠中SERT蛋白和SERTmRNA水平明显升高，与模型组比较有极显著性差异(P<0.01)。结论：电针可能是通过显著提升SERT蛋白和SERTmRNA的表达，促使空肠肠神经元突触间隙内的5-HT 摄取增多，减弱神经信号传导，致使空肠肠蠕动及分泌功能减弱，使得功能性腹泻大鼠空肠功能恢复正常。电针3组作用优于其他三组，提示取天枢干预功能性腹泻效果更好。

主题词功能性腹泻/针刺疗法穴，天枢动物,实验大鼠

功能性腹泻(Functional Diarrhea，FD)是一种临床常见疾病，以持续地、反复地出现糊状粪不伴有腹痛或腹部不适症状为主要表现，该病发病率呈现逐渐上升的趋势，其发病率占腹泻总数的59%[1]。肠道动力与SERT(serotonin reuptake transporter ,SERT)表达高低有着密切的关系[2]。本研究通过研究电针刺激不同穴位对FD大鼠空肠黏膜SERT蛋白及mRNA表达的影响，在分子生物学水平探讨针刺调节空肠动力障碍的穴位特异性。

1材料和方法

1.1动物及分组SPF级3.5月龄的SD大鼠60只, 平均体质量(230±20)g，由第四军医大学实验动物中心提供(动物合格证号：SCXK(陕)2014.036)，雌雄各半。实验动物随机分为正常对照组、FD模型组、EA I组 (造模+电针双侧上巨虚)；EA Ⅱ组(造模+电针双侧曲池)、EA Ⅲ组(造模+ 电针双侧天枢)、EA Ⅳ组(造模+ 电针双侧大肠俞)，每组10只。

1.2实验仪器及试剂3-16PK型通用台式高速离心机(德国Sigma公司)，Smartspec3000型紫外可见分光光度计(美国BIO-RAD公司)，NYCP-34ACG电泳仪(北京六一仪器厂)，90-2型恒温磁力搅拌器(上海振荣科学仪器有限公司)，Real-time PCR仪(美国stratagene公司)，PCR扩增仪(美国BIO-RAD公司)，SERT引物、内参Gapdh引物、逆转录试剂盒、PCR试剂盒、Trizol等(江苏卡尔文生物科技有限公司)，HANS-200A电针仪(南京济生医疗科技有限公司)，0.3mm×15mm寸毫针(苏州华佗医疗器械厂)。

1.3大鼠模型复制采用番泻叶90 g，6 倍量清水浸泡30 min，煎煮10 min 后，经纱布过滤，在50℃下，滤液通过旋转蒸发仪，减压浓缩至300mL，即得到0.3g生药/mL 药液，-20℃冰箱内保存，用时水浴加温至25℃，按10 mL/kg的剂量灌胃，每天1次，连续造模14d[3]。为消除生物节律的影响，每天同一时间进行束缚应激。停止灌胃后各组继续正常饲食、饮水，观察14d，至第28天造模结束。

1.4实验方法1.4.1电针1组(EAⅠ组)穴位定位：双侧上巨虚穴。根据李忠仁教授主编的《实验针灸学》[4]动物选穴标准，“上巨虚”穴：大鼠后肢足三里向下约5 mm 处。操作：选用“华佗牌”不锈钢针，30号1寸毫针。常规消毒后，毫针刺入各组相应穴位，针刺深度5 mm。电针仪：韩式电针仪( LH202H 型) ，疏密波，频率为疏波2 Hz，密波15 Hz，刺激强度以保持针刺局部轻微抖动为度(电流强度为1.5 mA，电压1～3V)。时间：留针20 min，持续电刺激，每日1 次，10 次为1 疗程，共治疗1个疗程。

1.4.2电针2组(EAⅡ组)穴位定位：双侧曲池穴。根据李忠仁教授主编的《实验针灸学》[4]动物选穴标准，“曲池”穴：桡骨近端的关节外侧前方凹陷中。操作方法及疗程同上。

1.4.3电针3组(EAⅢ组)穴位定位：双侧天枢穴。根据李忠仁教授主编的《实验针灸学》[4]动物选穴标准，“天枢”穴：脐中旁开5 mm 。操作方法及疗程同上。

1.4.4电针4组(EAⅣ组)穴位定位：双侧大肠俞穴。根据李忠仁教授主编的《实验针灸学》[4]动物选穴标准，“大肠俞”穴：第4腰椎棘突下，旁开5 mm。操作方法及疗程同上。

1.4.5正常对照组及FD模型组每日1次采取与以上四组相同的捉拿固定，但不施加任何干预措施。

1.5指标检测方法1.5.1Western Blot检测:应用试剂盒进行蛋白抽提， 匀浆至空肠组织完全裂解，将裂解液于4℃离心机中离心(10000×g,15min)，上清液转移入新的离心管中保存，用蛋白质定量试剂盒及酶标仪(Synergy2)测量562nm各孔光密度值，定量待测样品蛋白浓度。得到样品经电泳，转膜，封闭后加入SERT一抗(1:500)4℃过夜，Tris-HCL缓冲盐溶液(TBST)反复漂洗后加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔二抗(1:3000)室温避光孵育2h，TBST漂洗后用ECL法显影，结果用Bio-RAD Quantity one 图像分析软件进行扫描分析。以SERT的目的条带与内参GAPDH条带的比值代表个产物的相对表达量。

1.5.2 RT-PCR检测方法：首先提取总RNA，用PBS冲洗组织,加Tripure，冰浴下超声破碎细胞用氯仿振荡，静置后离心。每新离心管加异丙醇，混匀后离心，再加乙醇后混悬并洗涤沉淀, 再离心并除去上清后，沉淀到干燥器，使用超纯水处理使其溶解沉淀。再采用RT-PCR法，共36个循环，在取PCR产物，就进行琼脂糖凝胶电泳，采集部分采用UVP凝胶分析系统，分析结果的方法与western blot相同。

2结果

2.1一般情况比较造模成功后大鼠进食量减少，粪便粒数增加，处死后结肠内残留粪便粒数增多，给予电针干预后大鼠精神状态变好，进食量增加，粪便粒数增多，结肠内残留粪便粒数减少。

2.2腹泻指数见表1。针灸干预第10天后，与模型组比较，电针2组、3组、4组均能显著降低大鼠腹泻指数(P<0.05)，电针3组大鼠腹泻指数显著降低(P<0.05)，说明电针3组效果较好。

表1　各组大鼠腹泻指数的比较±s，n=10)

注:与空白组比较,▲P<0.01；与模型组比较, ◇P<0.05, ◆P<0.01。

2.3大鼠空肠SERT蛋白表达见图1。

图1　功能性腹泻大鼠空肠SERT蛋白表达

由图1可知，经Western blot检测结果显示,功能性腹泻大鼠模型组与空白组相比其空肠SERT的蛋白表达明显降低(P<0.01) ,说明造模可以使得5-羟色胺转运蛋白SERT 蛋白呈低表达，导致肠神经元突触间隙内的5-HT 过少摄取，神经信号传导增强，致使肠蠕动及分泌功能增强，出现腹泻;天枢组能够显著增加SERT蛋白表达(P<0.05)，说明电针天枢可使空肠神经元突触间隙内的5-HT摄取增多，致使空肠蠕动及分泌功能减弱；大肠俞组、上巨虚组和曲池组不能显著影响SERT蛋白表达(P>0.05) 。

2.4各组大鼠空肠黏膜SERTmRNA表达比较见图2。

图2　功能性腹泻大鼠空肠SERTmRNA表达

由图2可知，经RT-PCR检测结果显示,模型组与空白组相比其空肠SERTmRNA表达明显降低(P<0.01) ,说明造模可以使得5-羟色胺转运蛋白mRNA-SERTmRNA呈低表达，导致肠神经元突触间隙内的5-HT 过少摄取，神经信号传导增强，致使肠蠕动及分泌功能增强，出现腹泻;天枢组能够显著增加SERTmRNA表达(P<0.05)，说明电针天枢可使空肠神经元突触间隙内的5-HT摄取增多，致使空肠蠕动及分泌功能减弱；大肠俞组、上巨虚组和曲池组不能显著影响SERTmRNA表达(P>0.05)。

3讨论功能型腹泻属于中医“泄泻”范畴[5]。5-HT是一种联系脑肠轴、参与调节胃肠道运动和分泌功能的重要神经递质，其合成、释放及再摄取的改变均可能影响胃肠道功能，且其活动的终止与其发挥作用同样重要，如果它不能被及时摄取，受体处过多的5-HT可以引发胃肠道动力障碍，故其在FD的发病中有重要意义[6]；SERT是一种对5-HT有高度亲和力的跨膜转运蛋白，可将神经突触间隙尚未充分发挥生理效应的5-HT超前摄取，对在其受体处持续时间和信号空间分布的稳定调节发挥重要作用[7-8]，所以说SERT的异常表达是FD发病的间接原因。综上所述，SERT表达高低与肠道动力和分泌具有较为密切的关系,因此为了研究电针刺激不同穴位对功能性腹泻大鼠肠道动力的调节作用，我们以SERT蛋白表达的变化为评价指标。

电针作为治疗功能性腹泻的方法之一, 疗效确切, 作用稳定而持久, 在临床已得到证实。但针灸取穴的方法繁多复杂, 治疗功能性腹泻的特异性穴位处方的研究鲜见报道。现代医学研究体表刺激引起内脏功能活动的变化反应结果发现，神经节段在沟通体表与内脏中起到了至关重要的作用[9-10]。本研究根据神经节段分布选取4组穴位处方, 观察了不同穴位电针对功能性腹泻大鼠空肠SERT蛋白及SERTmRNA的影响。其中，天枢穴，为大肠经募穴，对胃肠功能可起到良性双向、整体性调节作用；大肠俞，为大肠之气转输之处，俞穴与脏腑有着直接的联系，是脏腑经脉之气所输注的部位，可调整肠道传输功能；曲池穴，为大肠经合穴，可使空肠、回肠、空肠的蠕动有即时性的改变, 蠕动弱者增强, 强者减弱；上巨虚穴为大肠经下合穴，从“合治内腑”的治疗原则出发，按疾病所属内腑的不同，而取其相应的下合穴治疗。

本研究通过番泻叶煎剂灌胃创立FD模型，首先，通过电针干预后，经western blot检测大鼠空肠SERT蛋白的表达，结果表明，电针刺激天枢穴相较于其他三组能够明显提高大鼠空肠SERT蛋白的表达，因此推测，电针刺激天枢穴可能通过提高SERT蛋白的表达,增加空肠肠神经元突触间隙内的5-HT摄取，减弱神经信号传导，致使空肠肠蠕动及分泌功能减弱，改善空肠动力障碍抑制肠蠕动，使功能性腹泻大鼠空肠功能恢复正常，这可能是电针治疗功能性腹泻的机制之一；其次，经RT-PCR检测大鼠空肠SERTmRNA的表达，结果表明，电针刺激天枢穴相较于其他三组能够明显升高大鼠空肠SERT蛋白的表达，因此推测，电针刺激天枢穴可能通过上调大鼠空肠黏膜SERT基因型的转录效率，从而使SERT基因表达上调，增加5-HT的重摄取速率，从而影响5-HT相应生理效应的强度和持续时间，改善空肠动力障碍抑制肠蠕动，使功能性腹泻大鼠空肠功能恢复正常。

本研究证实了电针对FD具有确切的疗效，其作用机理可能与调节SERT蛋白及mRNA的表达相关，以天枢穴对其调节更为显著，本法可能通过影响SERTmRNA转录水平，进而改变SERTmRNA蛋白表达量，最终良性调节FD大鼠空肠动力。我们通过不同穴位之间的比较，最终明确了针刺调节空肠动力障碍的穴位特异性，初步阐明了电针治疗腹泻的部分作用机制。

参考文献

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[2]Schaub N, Degen L.Functional diarrhea-pathophysiology, investigation and treatment[J]. Ther Umsch,2014,71(9):1024-1031.

[3]任立群,李才.人类疾病动物模型的复制[M].北京:人民卫生出版社,2008：257-258.

[4]李忠仁.实验针灸学[M].北京：中国中医药出版社,2004：327-329.

[5]刘燕,白世敬,马捷.功能性腹泻中医研究进展[J].辽宁中医药大学学报,2015,17(2):78-80.

[6]TackJ.Functional diarrhea[J].Gastroenterol Clin North Am,2012,41(3):1016-1022.

[7]王玉明,王邦茂,张维铭.功能性便秘、功能性腹泻和肠易激综合征病人SERT 基因多态性分析[J].基础医学与临床,2003,23(1):82-83.

[8]Kara G. Margolis,Korey D.Stevanovic.27 Effects of Gain-of-Function Mutation in the Serotonin Transporter (SERT) in Mice Suggest That 5-HT Functions in Intestinal Motility,Mucosal Maintenance, Inflammation,and Prevention of Bacterial Overgrowth and Translocation[J]. Gastroenterology,2014,146(5):8-15.

(收稿2016-01-05；修回2016-01-25)

【中图分类号】R442.2

【文献标识码】A

doi：10.3969/j.issn.1000-7369.2016.04.060

*国家重点基础研究发展计划项目(973计划)(2011CB505204)

△西安医学院(西安710002)

▲陕西中医药大学附属医院(咸阳712000)