可降解止血粉对家兔颅骨愈合的影响*

胡宗苗　周春梅　刘继平　张恩户　陕西中医药大学中药药理实验室(咸阳712046)



可降解止血粉对家兔颅骨愈合的影响*

胡宗苗周春梅刘继平张恩户△陕西中医药大学中药药理实验室(咸阳712046)

摘要目的：研究可降解止血粉对家兔颅骨愈合的影响。方法：取新西兰兔，麻醉后在颅骨同一位置处用骨钻钻2个圆形缺损孔洞，造成骨缺损模型，造模成功后，随机分成空白组、可降解止血粉组及骨蜡组。除空白组外其余两组分别给予50mg相同剂量的可降解止血粉、骨蜡完全覆盖。分别于处死动物前间隔7d耳缘静脉注射钙黄绿素和四环素做两次标记，6周后处死，取原缺损边缘扩展2.0cm范围的颅骨，进行骨质愈合情况评分，然后制作不脱钙骨切片，行组织病理学及荧光观察。结果：可降解止血粉组骨愈合效果明显优于空白对照组 (P<0.05)，骨蜡组明显差于空白对照组(P<0.05)。组织病理学结果显示，可降解止血粉组矿物质沉积速度明显高于空白对照组 (P<0.05)，骨蜡组明显低于空白对照组(P<0.05)；可降解止血粉组骨小梁面积比和矿化骨面积率较大，空白对照组次之，骨蜡组最小，而缺损面积比大小与骨小梁面积比呈现相反趋势，各组比较均有显著性差异。结论：可降解止血粉能促进颅骨愈合，而骨蜡则阻碍骨质生长。

主题词 颅骨骨折愈合/中医药疗法动物实验兔

骨折愈合是指骨折断端再连接的自然修复过程。促进骨折愈合是指应用药物或某些方法作用于局部或全身，使骨折后的骨组织修复能力增强、速度加快的过程。颅骨骨折和缺损是外伤及神经外科手术中经常面临的问题，促进修复愈合具有十分重要的临床意义，目前在此方面尚无较好的措施和手段。中医认为骨折最基本的病理变化是气滞血瘀，而使用中药促进骨折愈合被认为是一个瘀去、新生、骨合的过程，在治疗上一般早期使用活血药以祛瘀生新；然后用接骨续筋药促进愈合；最后则用补益药增强肝肾功能，加速愈合。随着现代分子生物学及新型医用材料的研究与开发，对中药有效部位及有效成分的研究日益增多[1-2]。可降解止血粉(Absorbable hemostatic powder)是一种从植物中提取的多糖高分子聚合物，临床使用发现其具有加速创面愈合的作用，但缺乏这方面的基础研究。本课题组以家兔颅骨损伤模型为实验对象，对可降解止血粉促进颅骨愈合作用进行评价，为其进一步开发临床使用提供科学依据。

1材料 1.1实验动物雌性新西兰兔24只，清洁级，体重2kg左右，购自第四军医大学实验动物中心，许可证号：SCXK-(军)2012-0007。饲养环境：陕西中医药大学中药药理实验室，动物分笼饲养，保持12h昼夜节律，室温为(22±1)℃，自由饮水摄食。

1.2药品与试剂可降解止血粉购自青岛颐中生物工程有限公司，批号1403008；骨蜡购自上海强生医疗器材有限公司，生产批号HL5BDPM；戊巴比妥钠，德国默克医药生物科技公司，批号140418；硫酸庆大霉素注射液，辰欣药业股份有限公司，批号1412182211。

1.3 仪器Leica 1600型硬组织切片机，德国LEICA公司；荧光显微镜，日本OLYMPUS公司；普通显微镜，厦门MOTIC公司；电子天平，赛多利斯科学仪器有限公司等。

2方法2.1造模与分组雌性新西兰兔适应性喂养一周，每只动物分别耳缘静脉注射3%戊巴比妥钠30mg/kg麻醉，俯卧固定于手术台上，手术暴露颅骨，剥开骨外膜，以直径6mm钻头在颅骨中缝两侧距离1.5cm的位置处钻出2个圆形缺损孔洞，造成骨缺损模型[3]。造模成功后，随机分成空白组、可降解止血粉组及骨蜡组，每组8只。除空白组外其余两组分别给予50mg相同剂量的可降解止血粉、骨蜡完全覆盖，逐层缝合，术后连续 3d肌肉注射庆大霉素预防感染。分别于处死前7d耳缘静脉注射钙黄绿素(2%的碳酸氢钠溶解)20mg/kg；处死前1天另一侧耳缘静脉注射四环素(双蒸水溶解)30mg/kg[4]，6周后处死。

2.2取材与标本处理动物处死后取原缺损边缘扩展2.0cm范围的颅骨，大体观察进行骨愈合评分，制作不脱钙骨切片，行组织病理学及荧光观察。

2.2.1缺损处骨愈合评分标准：见表1。

表1　 骨质愈合评分标准

2.2.2矿物质沉积速度(Mineral apposition rate， MAR):通过测量四环素和钙黄绿素两条荧光标记线之间的距离，计算矿物质沉积速度。计算公式：MAR=(两次标记荧光线距)(μm)/(两次给药间隔天数)(d)。

2.2.3骨小梁面积比与缺如面积比:V-G染色法用来计算原缺损区域内骨小梁的形成情况[5]。计算公式如下：骨小梁面积比=(缺损孔骨小梁面积)/(缺损孔总面积)；缺如面积比=(缺损孔缺如区域面积)/(缺损孔总面积)。

2.2.4矿化骨面积率:硝酸银染色法用来计算原缺损区域内矿化骨的形成情况。计算公式如下：矿化骨面积率=(缺损孔矿化骨面积)/(缺损孔总面积)。

3结果3.1缺损处骨愈合评分可降解止血粉骨愈合效果明显优于空白组(P<0.05)；骨蜡组骨愈合程度明显差于空白组(P<0.05),见表2。

表2　新西兰兔颅骨缺损孔各级别孔数

注：与空白对照组比较，∆P<0.05

3.2 组织病理学3.2.1矿物质沉积速度:可降解止血粉组矿物质沉积速度明显高于空白组(P<0.05)；骨蜡组明显低于空白组(P<0.05)(见表3，图1)。

表3　各组矿物质沉积速度

注：与空白对照组比较,∆P<0.05

表4　各组骨小梁面积比与缺如面积比±s，n=16)

注：与空白对照组比较∆P<0.05

表5　各组矿化骨面积率±s)

注：与空白对照组比较,∆P<0.05

3.2.2 骨小梁面积比与缺如面积比:骨小梁可以被V-G染色法染成红色，根据染色结果计算骨小梁面积比及缺损面积比。结果显示可降解止血粉组面积较大，空白对照组次之，骨蜡组的骨小梁面积比最小。各组值间的比较均有统计学差异。缺损面积比大小与骨小梁面积比大小呈现相反的趋势(见表4，图2)。

3.2.3矿化骨面积率：硝酸银染色法可将原缺损区域内矿化骨染成暗红色。根据染色计算矿化骨面积。骨蜡组矿化骨面积比最小，空白对照组次之，可降解止血粉面积较大。各组值比较均有统计学差异(见表5，图3)。

4讨论 调动人体一切积极因素参加骨与周围组织的损伤修复过程是现代医学对骨折愈合的认识，主要涉及多种细胞的增殖，分化及细胞外基质的合成与钙化[6]。促进骨折愈合是指应用药物和某些方法作用于全身或局部，使骨折后的骨组织修复能力增强的复杂生理过程，该过程又可分为为血肿机化期，原始骨痂期和骨痂改造期三个时期[7]。

近年来中药在骨折愈合方面的机制研究不断深入，从改善循环以消除血肿，促进基质胶原合成和钙盐沉积，提高微量元素含量并刺激骨生长因子分泌，提高成骨细胞活性和骨痂生物力学性能等多方面促进骨折愈合。在治疗方面中药更是显示出独特的优势，尤其是外用中药，吸收分布快，药效迅速而直接，受体内灭活代谢与生物转化影响小，在促进骨折断端紧密靠拢、增强骨折愈合方面有其优势。可降解止血粉是由天然植物提取，通过物化反应制备而成的一种无菌可降解止血粉。本实验观察了可降解止血粉对新西兰兔颅骨愈合的影响，结果显示，可降解止血粉有显著的促进骨愈合作用。这可能是由于该药对手术、烧烫伤和外伤创面发挥止血作用的同时，其独有的氨基酸成分加速了创面愈合，同时其溶解后所带的负电荷，刺激了组织细胞生长，加速了组织愈合。

综上所述，可降解止血粉在一定程度上改善了新西兰兔颅骨损伤的组织形态，有一定程度的加快骨折愈合的作用，具有良好的促进骨生长的能力，可显著促进颅骨缺损处的修复，以上研究结果可为该药促进骨愈合的临床用途提供科学依据。

参考文献

[1]朱建富,郑海荣,曾焕友. 骨折术后患者应用活血化瘀类药物促进骨折愈合的近期与远期疗效[J].辽宁中医杂志,2015,42(3):509-511.

[2]刘兴坤,谷福顺. 单味中药及其有效成分骨折愈合作用的研究进展[J].中医正骨,2012,24(5):75-77.

[3]白峰，李国臣，刘建，等.多孔磷酸钙骨水泥与钛合金支架材料修复兔颅骨骨缺损的比较研究[J].稀有金属材料与工程,2010,39(11):1984-1988.

[4]车向新,曹俊,黄小林,等. 自制诱导型人工骨材料修复兔颅骨缺损实验研究[J].中国现代医学杂志,2013,23(14):11-17.

[5]牛雯,刘毅,张博,等. 可吸收性多聚糖止血材料PerClot®对颅骨愈合的影响[J].中国组织工程研究与临床康复,2010,14(34):6351-6354.

[6]苏发丽,李利华,赵丽萍,等.生长因子在骨折愈合过程中作用的研究进展[J].现代生物医学进展,2013,26(33):5173-5175.

[7] 马莎,李玛琳.中药促进骨折愈合及其机制的研究进展[J].西部医学,2011,23(8):1603-1606.

(收稿2015-10-07;修回2015-10-28)

Effects of Absorbable Hemostatic Powder on bone healing in rabbits Laboratory of Pharmacology of Chinese Materia Medica，Shaanxi University of

Chinese Medicine(Xianyang 712046)Hu ZongmiaoLiu JipingZhou Chunmeiet al

ABSTRACTObjective: Study on the effect of the Absorbable Hemostatic Powder on the healing of rabbit skull. Methods: After anesthesia, 2 circular defect cavities were drilled at the same location in the same position of the skull. The bone defect model and the model of the bone defect were randomly divided into two groups. The defects in each group were completely covered with the same dose of 50mg and the Absorbable Hemostatic Powder at the same dose, and the negative control group was not used in any of the materials. The rats were sacrificed respectively before the interval 7d ear vein injection of tetracycline and calcein labeled two times. After feeding for six weeks. Take the original defect edge extended range of 2.0 cm skull, gross observation of bone healing was healing score, and undecalcified bone sections, organization learning and fluorescence observation. Results: The effect of the Absorbable Hemostatic Powder group was significantly better than that the blank control group (P<0.05),and the bone wax group was significantly worse than that in the control group (P<0.05). The results showed that the rate of mineral deposition in the powder group was significantly higher than that in the blank control group (P<0.05), and the bone wax group was significantly lower than that in the control group (P<0.05). Trabecular bone area rate of bone wax and mineralized bone area than the smallest group, blank control group, Absorbable Hemostatic Powder group greatly. The area ratio of the defect area and bone was the opposite trend. There were significant differences in the values of the groups. Conclusion：Absorbable Hemostatic Powder can promote bone healing, and bone wax hinder bone growth.

KEY WORDSSkull fracture healing / traditional Chinese medicine therapyAnimal experimentationRabbits

【中图分类号】R683.5

【文献标识码】A

doi:10.3969/j.issn.1000-7369.2016.02.049

通讯作者∆

*陕西省教育厅重点科研计划项目(15JS022)