发酵期慕萨莱思中乳酸菌的分离及表型鉴定

高 荣　陈春杨　张秀萍

(塔里木大学动物科学学院， 新疆 阿拉尔 843300)



发酵期慕萨莱思中乳酸菌的分离及表型鉴定

高 荣陈春杨张秀萍*

(塔里木大学动物科学学院， 新疆 阿拉尔 843300)

摘要为了解处于发酵期的慕萨莱思中乳酸菌(LAB)种类，对第10，20天的发酵液中乳酸菌进行分离并鉴定。采用平板菌落计数法计算发酵液中的乳酸菌总数，选择性培养基MRS、M17对慕萨莱思发酵液中的乳酸菌杆菌和球菌进行筛选，然后对分离株革兰氏染色后显微镜镜检观察菌体形态，生理生化生物学特性试验等方法鉴定属种。结果，此次样品第10,20天发酵液中的乳酸菌数量分别是3.9×105 cfu/ml，5.0×105 cfu/ml；得到7种乳酸菌，分别是德氏乳杆菌德氏亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.delbrueckii)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、干酪乳杆菌干酪亚种(Lactobacillus casei cheese subsp.casei)、酒酒球菌(Oenococcus oeni)、藤黄微球菌(Micrococcus luteus)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、糊精片球菌(Pediococcus dextrinicus)，它们是此次慕萨莱思样品处于发酵期微生态环境中的部分组成成分。

关键词乳酸菌； 分离； 表型鉴定； 慕萨莱思

1引言

慕萨莱思是新疆特产，主产地在阿瓦提县，是一种酿造的味美醇香的葡萄酒。葡萄酒中存在的细菌主要为乳酸菌 ,它们的存在对葡萄酒的品质会产生有利或有害的影响[1]：有益乳酸菌主要通过苹果酸-乳酸发酵(MLF)、柠檬酸发酵、果糖和葡萄糖发酵,正常进行的MLF、柠檬酸发酵产物双乙酰(2,3-丁二酮)及其衍生物(2,3-丁二醇)对葡萄酒具有改善口感，增香作用；有害乳酸菌通过分解残糖和柠檬酸,增加葡萄酒的挥发酸度，使酒出现丝状混浊，沉淀，产生异味物质，甚至高浓度的生物胺。目前对慕萨莱思发酵过程中乳酸菌的种类及作用研究报道的还很少，因此，本研究采用选择性培养基对慕萨莱思发酵过程中的乳酸菌进行筛选，从形态与理化特征方面进行鉴定属种，了解发酵阶段慕萨莱思葡萄酒中乳酸菌的种类，为进一步探索乳酸菌影响慕萨莱思葡萄酒品质的机制提供材料。

2材料和方法

2.1材料

新疆阿克苏地区阿瓦提县刀郎酒厂发酵第10,20天的慕萨莱思发酵液各3瓶，500 ml/瓶。

培养基：MRS，M17，生化鉴定试剂购自青岛海博生物技术有限公司。

厌氧产气袋，购自北京陆桥技术股份有限公司。

2.2方法

2.2.1乳酸菌细菌总数计数

按平板菌落计数法[2]。吸取原液进行连续稀释,将1:1 000，1:10 000，1:100 000稀释度的稀释液与MRS、M17琼脂培养基混匀，置于37 ℃恒温培养箱中厌氧培养48 h后计数。

2.2.2乳酸菌的分离

将原液、稀释液接种于MRS、M17琼脂固体培养基和液体培养基，于37 ℃恒温培养箱中厌氧培养48 h～72 h，挑选形态有差异的单菌落划线接种到MRS固体平板培养基进行纯化。将分离到的革兰氏染色阳性、过氧化氢酶阴性的杆菌接种至MRS固体斜面，球菌接种到M17固体斜面，于4 ℃中保存备用。

2.2.3乳酸菌的鉴定

根据凌代文《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》[3]及张刚《乳酸细菌:基础、技术及应用》[4]中有关乳酸菌形态和生理生化特性进行相关试验：菌落、菌体形态的观察，运动性检查，耐盐性试验(NaCl%:5%,18%)，耐酸性试验(pH范围3. 5、4. 5、5. 5、6. 5)，温度试验(10 ℃，45 ℃),葡萄糖酸盐试验，糖类发酵试验(阿拉伯糖、半乳糖、乳糖、纤维二糖、果糖、蔗糖、海藻糖、甘露醇、鼠李糖、甘露糖、山梨醇)。

3结果

3.1乳酸菌的计数

刀郎酒厂慕萨莱思发酵第10、20天乳酸菌数为3. 9×105cfu/ml，5. 0×105cfu/ml。

3.2乳酸菌的鉴定

分离获得7株乳酸菌C1、C2、C3、Q1、Q2、Q3、Q4，依次为德氏乳杆菌德氏亚种、植物乳杆菌、干酪乳杆菌干酪亚种、酒酒球菌、藤黄微球菌、嗜热链球菌、糊精片球菌。图1为7株乳酸菌的形态特征，表1对分离到的乳酸菌的菌落、菌体形态特征进行了描述，表2记录了7株乳酸菌的部分生化特性。

3株乳杆菌属的细菌：德氏乳杆菌德氏亚种、植物乳杆菌、干酪乳杆菌干酪亚种。分离株德氏乳杆菌德氏亚种，利用葡萄糖产酸不产气，可以发酵葡萄糖酸盐，也可以发酵纤维二糖、果糖、蔗糖、海藻糖，不能利用其它碳水化合物。植物乳杆菌发酵葡萄糖产酸不产气，发酵葡萄糖酸盐，纤维二糖、果糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖，不发酵鼠李糖。干酪乳杆菌干酪亚种从葡萄糖产酸不产气，发酵葡萄糖酸盐，半乳糖，果糖等单糖，也能发酵蔗糖，纤维二糖等双糖，不能发酵鼠李糖。

4株乳酸球菌属的细菌：酒酒球菌、藤黄微球菌、嗜热链球菌、糊精片球菌。分离株酒酒球菌，细菌链状排列，从葡萄糖产酸产气，发酵葡萄糖酸盐、葡萄糖、果糖、蔗糖，不运动，pH3. 5～6. 5环境中都可以生长。藤黄微球菌，球形密集排列，接触酶阳性，不分解葡萄糖，发酵葡萄糖酸盐，能在5%NaCl中生长，不运动。嗜热链球菌细胞链状排列，从葡萄糖产酸不产气，发酵葡萄糖酸盐、乳糖、纤维二糖，不可发酵甘露醇，山梨醇，在10℃不生长而在45℃生长，可以运动。糊精片球菌，四联状，可利用葡萄糖产酸不产气，发酵葡萄糖酸盐、蔗糖，半乳糖，甘露糖，不发酵海藻糖，甘露醇，鼠李糖，不能生长于18%NaCl中，不运动。

图1　7株乳酸菌的形态特征

注：依次为C1德氏乳杆菌德氏亚种、C2植物乳杆菌、C3干酪乳杆菌干酪亚种、Q1酒酒球菌、Q2藤黄微球菌、Q3嗜热链球菌、Q4糊精片球菌,革兰氏染色，100×10。

表1　7株乳酸菌的菌落、菌体形态特征

表2　7株乳酸菌的部分生化特性鉴定结果

续上表

试验项目C1C2C3Q1Q2Q3Q4海藻糖++++++-甘露醇-++----鼠李糖-------甘露糖+++++++山梨醇--+++-+

4讨论与结论

在良好的条件下，葡萄酒酿造过程乳酸菌的生长周期包括3个主要阶段：(1)潜伏阶段，此阶段乳酸菌群体数量下降，但保留下最适应葡萄酒环境的自然选择群体；(2)繁殖阶段，出现在酒精发酵结束后，乳酸菌迅速繁殖并使其群体数量达到最大值；(3)平衡阶段：乳酸菌群体数量几乎处于平衡、稳定状态。在适宜的条件下，该阶段可持续很长时间。本实验样品中第10，20天的乳酸菌数分别是3. 9×105cfu/ml，5. 0×105cfu/ml，说明乳酸菌群体数量变化很小，进入平衡阶段，推测该样品慕萨莱思发酵第10～20天期间可能是MLF发酵的第3阶段。

从发酵食品中不断获得到多株具有MLF良性发酵且较高抗氧化活性的乳酸菌，使得乳酸菌日益成为研究的热点。研究表明片球菌，植物乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种等乳酸菌不仅可以改善葡萄酒的口感和风味，还可以增强葡萄酒的抗氧化性，抑制病原体的生长,清除自由基[5,6,7]。嗜热链球菌产生的乳酸链球菌素是天然的防腐剂，糊精片球菌不仅可以作为促酵剂物，而且有些可以降低发酵产物中的含胺量。同时，多数研究认为酒类酒球菌、片球菌是葡萄酒发酵过程中的有害菌。此次在MLF发酵过程中分离到的7株乳酸菌对慕萨莱思品质走向将起到何种作用，尚待进一步研究。

综上所述，本次研究得到了慕萨莱思发酵过程中的7种乳酸菌，它们是此次样品微生态系统中的部分组成成分。

参考文献

[1]权英，王颉，张伟.葡萄酒中的乳酸菌[J].酿酒科技.2002(2):59-62.

[2]GB/T4789.2-2010.中华人民共和国国家标准.食品卫生微生物学检验 菌落总数测定[s].2010:1-4．

[3]凌代文，东秀珠.乳酸细菌分类鉴定及实验方法[M].北京:中国轻工业出版社，1999:63-67.

[4]张刚.乳酸细菌:基础、技术和应用[M].北京化学工业出版社,2007：129-134.

[5]刘莉萌，张斌，东秀珠，等.浓香型白酒窖池中片球菌的分离与鉴定[J].酿酒科技,2007(2):22-25.

[6]黄珊珊，刘晶，赵征.植物乳杆菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种菌体外抗氧化活性的对比研究[J].中国乳品工业.2010,38(10)：8-10，27.

[7]段浩云.田洪涛.檀建新，等.葡萄酒MLF高耐受性优良乳酸菌的筛选与鉴定[J].中国食品学报.2015,15(5):200-205.

Isolation and Phenotypic Identification of Lactic Acid Bacteria from Msalais Fermentation Liquor

Gao RongChen ChunyangZhang Xiuping*

(College of Animal Science, Tarim University, Alar, Xinjiang 843300)

AbstractIn order to understand LAB(Lactic Acid Bacteria) from Msalais fermentation liquor, lactic acid bacteria were isolated and identified in from the 101hand 202hfermentation. Colony Counting Method was used to estimate the total number of LAB.Lactic acid bacteria and coccus were screened by selective culture medium MRS and M17 in Msalais fermentation liquid. Identificated the species Species of LAB were identificated through cell morphology observation after Gram's stain and tests of physiological and biochemical characteristics. The results show that the total number of LAB maintains about 3.9×105 cfu/ml and 5.0×105 cfu/ml on the 10th and 20th day. Seven species of LAB were collected, and they were Lactobacillus delbrueckii subsp.delbrueckii, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus casei cheese subsp.casei, Oenococcus oeni, Micrococcus luteus, Streptococcus thermophilus, Pediococcus dextrinicu. They composed the micro-ecological environment of the Msalais fermentation liquor.

Key wordsLAB(Lactic Acid Bacteria)； isolation； phenotypic identification；Msalais

中图分类号：TS201.3

文献标识码：A

DOI：10.3969/j.issn.1009-0568.2016.02.002

文章编号：①1009-0568(2016)02-0008-04

作者简介：高荣(1992-)，女，2015届本科生，研究方向为发酵食品乳酸菌。E-mail：102323664@qq.com*为通讯作者E-mail：zxpdky@126.com

基金项目：塔里木大学动物科学学院大学生创新项目(DKY2013003)；塔里木大学校长基金项目(TDZKSS201403)。

收稿日期：①2015-05-08