5-Br-PADAP分光光度法测定手掌面镀锌工具遗留印迹的锌含量

杨瑞琴、邢 卓、周 红

1. 中国人民公安大学刑事科学技术学院、北京 100076 2. 公安部物证鉴定中心、北京 100038

5-Br-PADAP分光光度法测定手掌面镀锌工具遗留印迹的锌含量

杨瑞琴1、邢 卓1、周 红2

1. 中国人民公安大学刑事科学技术学院、北京 100076 2. 公安部物证鉴定中心、北京 100038

研究2-(5-溴-2吡啶偶氮)-5-二乙氨基苯酚(5-Br-PADAP)分光光度法测定手掌面镀锌工具遗留印迹的锌含量。考察了缓冲液用量、pH、显色剂用量等反应条件对测定的影响； 在优化好的条件下、建立了标准曲线并测定了不同接触时间、时间间隔条件下手掌面镀锌工具遗留印迹的锌含量。研究结果表明、pH 8.0的硼砂-硼酸缓冲液4 mL、1 g·L-1的5-Br-PADAP溶液0.2 mL以及10%曲拉通-X-100溶液1 mL为最佳测定条件、在此条件下、Zn2+在0～14 μg范围内呈良好的线性关系、回归方程为y=1.851 34x+0.002 29； 在接触时间10 s～5 min内、手掌面镀锌工具遗留印迹锌含量呈上升趋势、在5～10 min内趋于平缓、在接触时间5 min时已基本达到饱和状态、锌含量在0.425～2.377 μg·cm-2； 手掌面镀锌工具遗留印迹锌含量在间隔时间0～2 h急剧下降、在2～7 h内下降的幅度逐渐变小、当间隔时间达到7 h时、锌含量仅为0.188 μg·cm-2、与间隔0 h锌含量相比减少了约90%。因此、微量金属显现实验一定要尽早进行。此外、不同间隔时间条件下手掌面锌含量的变化规律与喷洒显现实验中遗留印迹强度变化并非完全对应、这说明手掌面上的锌含量并非唯一可以影响不同间隔时间条件下遗留印迹强度的因素。首次在实验中证实了Zn2+与蛋白质结合后可以被络合能力更强的5-Br-PADAP分子夺取出来而显色的假设。运用此种宏观微观相结合的方法进行研究、有利于对微量金属显现实验中各影响因素机理的探讨、为进一步的研究奠定了基础。

法庭科学； 分光光度法； 2-(5-溴-2吡啶偶氮)-5-二乙氨基酚； 锌

引 言

微量金属显现实验(trace metal detection test)[1]是一种通过显现作案人与金属工具接触后遗留在皮肤上的微量金属、反映金属工具的外形轮廓和细节特征、从而证明作案人与金属工具之间关联性的检测方法、此方法能够为刑事侦查提供破案线索以及为法庭审判提供关联证据。

随着此方法的广泛应用、专家用肉眼观察定性评价所显现遗留印迹的显现效果已经不能满足证据鉴定的需要[2]。Avissar等[3]首次对不同接触时间条件下手掌面铁质客体遗留印迹中铁含量进行了定量测定、但其所采用的测定方法准确性较差； 王丽婷[4]报道了时间间隔因素也是影响遗留印迹显现效果的主要因素、但相关定量测定尚属空白； 此外、除了铁质工具外、镀锌工具也是犯罪现场的常用工具。由于锌离子与铁离子在配位能力上存在差异、尤其是在手面皮肤这样复杂的生物基质中、两者的差异可能更加明显。因此、有必要对不同接触时间以及间隔时间下手掌面上锌含量进行测定。

采用2-(5-溴-2吡啶偶氮)-5-二乙氨基酚(5-Br-PADAP)作为Zn2+显色剂。它是一种优良的分析试剂、具有灵敏度高、毒性低等特点、已广泛用于光度分析、色谱分析以及电化学分析[5]。实验中首先通过考察缓冲溶液用量、pH、显色剂用量、曲拉通-X-100用量对测定的影响、优化出测定Zn2+的最佳实验方法、并建立Zn2+的标准曲线。其次、按优化的实验条件测定不同接触时间、时间间隔条件下、手掌面镀锌工具遗留印迹的锌含量。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

仪器：721型紫外-可见分光光度计(北京普析通用仪器有限公司)； PB-10型精密酸度计(德国赛多利斯有限公司)； BS124S型电子天平(德国赛多利斯有限公司)。

5-Br-PADAP溶液：1 g·L-1； 硼酸-硼砂缓冲溶液：pH值为7.2～9.2； 曲拉通-X-100溶液：10%； Zn2+标准溶液：1 mg·mL-1和10 μg·mL-1。

1.2 方法

选取手掌面湿度为 “中等”的志愿者[4]、让其手握镀锌管件(与皮肤接触面积为20.5 cm2)一定时间并且间隔一定时间、到达预定时间后、用去离子水冲洗接触部位、用表面皿收集提取液、收集后转移到10 mL容量瓶中、待测。之后、取pH 8.0的硼砂-硼酸缓冲液4.0 mL于25 mL容量瓶中、依次加入1.0 mL上述提取液、10%曲拉通-X-100溶液1.0 mL、1 g·L-1的5-Br-PADAP溶液0.2 mL、用去离子水定容。在室温静置10 min后、移入1 cm比色皿中、以试剂空白做参比、在波长558 nm处测量其吸光度。在每次提取镀锌工具遗留印迹后、用热水和洗手液洗手、间隔4 h后再进行平行实验。

2 结果与讨论

2.1 最佳波长的选择

按1.2中实验方法、在波长500～600 nm范围内扫描。结果表明、Zn2+-5-Br-PADAP的最大吸收波长位于558 nm。

2.2 反应条件优化

2.2.1 缓冲溶液pH的优化

由于人体汗液的pH值大多分布在6.5～8.1之间[6]、同时5-Br-PADAP在弱碱性范围内显现Zn2+的吸光度稳定、因此将缓冲溶液的pH值设置在7.2～9.2范围内。结果表明、在pH值7.2～9.2的范围内吸光度基本稳定、本实验选用pH 8.0的硼酸-硼砂缓冲溶液。

2.2.2 缓冲溶液用量优化

考察了缓冲液用量对络合物吸光度的影响。结果表明、缓冲溶液用量在1.0～5.0 mL吸光度基本稳定、本实验选用缓冲溶液用量为4.0 mL。

2.2.3 显色剂用量优化

考察了显色剂用量对络合物吸光度的影响。结果表明、随着显色剂用量的增加、络合物的颜色逐渐变深、在0.15～0.25 mL范围内吸光度稳定且完全、本实验选择显色剂用量为0.20 mL。

2.2.4 曲拉通-X-100用量优化

考察了曲拉通-X-100用量对络合物吸光度的影响。结果表明、曲拉通-X-100用量对吸光度影响不大、主要起到增溶的作用、本实验选择曲拉通用量为1 mL。

2.3 共存离子的影响及掩蔽

2.4 标准曲线的绘制

在优化好的条件下、配制系列浓度2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0和14.0 μg·mL-1的Zn2+溶液、分别取1.0 mL置于25 mL容量瓶中、测定不同浓度Zn2+溶液与络合物吸光度之间关系。结果表明、Zn2+在0～14 μg范围内呈良好的线性关系、回归方程为y=1.851 34x+0.002 29、R2=0.999 78、吸光系数ε558 nm=1.21×105L·mol-1·cm-1。

2.5 手掌面镀锌工具遗留印迹锌含量的测定

采用单位面积内锌含量来评价手掌面镀锌工具遗留印迹的锌含量、即在根据标准曲线测得镀锌客体遗留印迹的总锌量后、用其与接触部位面积做商。

2.5.1 不同接触时间条件下手掌面镀锌工具遗留印迹锌含量的测定

选取手掌面湿度为“中等”的志愿者[4]、让其手握镀锌管件10 s～10 min、之后立即采用1.2中实验方法进行提取、测定、实验结果如图1所示。从图1可以看出、随着接触时间的增加、手掌面镀锌工具遗留印迹的锌含量呈上升趋势、在5 min基本达到饱和状态、这可能是因为先转移到手掌面的Zn2+阻碍了汗液和镀锌工具的进一步接触[7]； 从图1还可以看出、在10 s～10 min、手掌面镀锌工具遗留印迹的锌含量为0.425～2.377 μg·cm-2。由此可见、手掌面通过与镀锌工具接触而转移的Zn2+属于微量级、而且人们的日常活动以及皮肤自身的络合都会导致其含量进一步降低、因此微量金属显现实验务必要尽早进行。

图1 不同接触时间下手掌面镀锌工具遗留印迹锌含量

2.5.2 不同时间间隔条件下手掌面镀锌工具遗留印迹锌含量的测定

选取手掌面湿度为“中等”的志愿者、固定接触时间为3 min、分别间隔0～7 h后采用1.2实验方法进行提取、测定、实验结果如图2所示。从图2可以看出、随着间隔时间的增大、手掌面镀锌工具遗留印迹的锌含量逐渐减少、当达到7 h时、锌含量仅为0.188 μg·cm-2、与0 h锌含量相比减少了约90%、这可能是由于随着间隔时间的增大、与手掌面上的角蛋白络合的Zn2+增多[8]、Zn2+随金属转运蛋白穿过表层皮肤进入真皮[9]以及部分与蛋白质结合的Zn2+通过自然脱落的方式损失[10]、从而导致手掌面镀锌工具遗留印迹锌含量下降。

在喷洒显现实验中、手掌面镀锌工具遗留印迹强度随时间间隔增大而减弱。在间隔1～2 h时、遗留印迹强度减弱程度不大、但在间隔2～7 h时、遗留印迹的强度急剧减弱； 而手掌面上镀锌工具遗留印迹锌含量在间隔1～2 h内却急剧下降、在2～7 h减弱程度放缓、如图2所示。二者存在明显的差别、这说明手掌面上的Zn2+含量并不能完全决定镀锌工具遗留印迹的强度、它只是Zn2+参与反应的一种形式。当间隔1～2 h时喷洒5-Br-PADAP溶液、除游离态的Zn2+外、已与角蛋白结合的Zn2+[11]会被络合能力更强的5-Br-PADAP分子夺取出来而显色、从而在手掌面上锌含量急剧减少的情况下、镀锌工具遗留印迹仍保持较高强度； 但若时间间隔进一步增大、游离态的Zn2+进一步减少、而且较早与角蛋白结合的Zn2+会与角蛋白生成更加稳定的络合物、从而难以被夺取出来、由此5-Br-PADAP分子只能与少量游离态的Zn2+以及较晚与角蛋白结合的Zn2+络合、遗留印迹强度急剧下降。总体来说、随着时间间隔的增大、与角蛋白结合的游离态Zn2+增多、生成Zn2+-角蛋白稳定络合物越来越多以及其他方式损失的Zn2+增多三方面因素共同造成了遗留印迹的强度的减弱。

图2 不同时间间隔下手掌面镀锌工具遗留印迹锌含量

3 结 论

以5-Br-PADAP为显色剂、通过优化缓冲溶液用量、pH、显色剂用量、曲拉通-X-100用量等条件、建立了测定手掌面镀锌工具遗留印迹锌含量的光度分析法、并测定了不同接触时间、不同时间间隔条件下手掌面镀锌工具遗留印迹的锌含量。

研究结果表明、在接触时间10 s～5 min内、手掌面镀锌工具遗留印迹锌含量成上升趋势、在5～10 min内趋于平缓、在接触时间5 min时已基本达到饱和状态、锌含量在0.425～2.377 μg·cm-2、属于微量级别； 在间隔时间0～7 h内、手掌面镀锌工具遗留印迹锌含量在间隔时间0～2 h急剧下降、2～7 h内下降的幅度逐渐变小、当达到7 h时、锌含量仅为0.188 μg·cm-2、与间隔0 h锌含量相比减少了约90%。因此、微量金属显现实验一定要尽早进行。此外、不同间隔时间条件下手掌面Zn2+含量的变化规律与喷洒显现实验中遗留印迹强度变化并非完全对应、这说明手掌面上的Zn2+并非唯一可以影响遗留印迹显现效果的因素、首次在实验中证实了Zn2+与蛋白质结合后还可以被络合能力更强的5-Br-PADAP分子夺取出来而显色的假设。运用此种宏观微观相结合的方法进行研究、有利于对各影响因素机理的探讨、为进一步的研究奠定了基础。

[1] Stevens J M、Messler H. Journal of Forensic Science、1974、19(3)：496.

[2] Leifer A、Avissar Y、Berger S、et al. Journal of Forensic Science、2001、49(6)：1442.

[3] Avissar Y、Sagiv E、Mandler D、et al. Journal of Forensic Science、2004、49(6)：1.

[4] WANG Li-ting、YANG Rui-qin (王丽婷,杨瑞琴). Chemical Reagent(化学试剂)、2014、36(4)：348.

[5] YU Xiu-lan、TIAN Song-tao、MENG Fan-jin(于秀兰、田松涛、孟凡金). Rock and Mineral Analysis(岩矿测试)、2011、30(2)：131.

[6] WANG Li-ting、YANG Rui-qin、ZHANG Kai-feng(王丽婷、杨瑞琴、张凯峰). Physical Testing and Chemical Analysis Part B·Chemical Analysis(理化检验-化学分册)、2014、50(4)：406.

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[11] Almog J、Bar-or K、Leifer A、et al. Forensic Science International、2014、241(8)：55.

Spectrophotometric Determination of the Amount of Zinc on the Imprint Left on Hands by Zinc Coatings with 5-Br-PADAP as the Chromogenic Reagent

YANG Rui-qin1,XING Zhuo1,ZHOU Hong2

1. School of Forensic Science,People’s Public Security University of China,Beijing 100076,China 2. Institute of Forensic Science,Ministry of Public Security,Beijing 100038,China

Spectrophotometric determination of the amount of zinc on the imprint left on hands by zinc coatings with 2-(5-Bromo-2-pyridylazo)-5-(diethylamino)-phenol (5-Br-PADAP) as a chromogenic reagent has been studied in this paper. The effect of reaction conditions including volume and pH of buffer solution as well as the volume of chromogenic reagent on the determination has also been studied. On the optimized condition,the standard curve of zinc has been established and the amount of zinc on the imprint left on hands by zinc coatings with different contact time and time elapse has been determined separately. As the results shown,the optimized reaction condition is 4 mL of boric acid and borax buffer solution(pH 8.0),0.2 mL of 5-Br-PADAP with the concentration of 1 g·L-1and 1 mL of Triton-X-100 with volume fraction of 10%. Under this circumstance,high linearity of zinc is followed between 0 and 14 μg and the regression equation of zinc isy=1.851 34x+0.002 29. The amount of zinc on the imprint left on hands by zinc coatings,ranging from 0.425 to 2.377 μg·cm-2,increases with contact time from 10 second to 5 min and varies insignificantly from 5 to 10 min. The amount of zinc left on hands declines sharply with time elapse from 0 h to 2 h,and then slowly from 2 to 7 h. The amount of zinc within 7 h is only 0.188 μg·cm-2,which is 90% lower than that of 0 h. Therefore,it is suggested that the trace metal detection should be conducted as soon as possible. Besides,the amount of zinc on the imprint left on hands by zinc coatings with different time elapse is not entirely comply with the intensity of imprint left by zinc coatings. This demonstrates that the amount of zinc on hands is not the only factor influencing the intensity of imprint on hands with different time elapse. Additionally,it also proves the hypothesis that zinc in the complex of zinc and protein can be captured and bonded by 5-Br-PADAP resorting to a stronger chelating capacity in the experiment for the first time. The application of the combined methods in a macro and micro view is useful for study in mechanism of influencing factors in trace metal detection,which lays foundations l for further researches.

Forensic science； Spectrophotometry； 5-Br-PADAP； Zinc

Jul. 18,2015; accepted Nov. 5,2015)

2015-07-18、

2015-11-05

公安部技术研究计划项目(2015JSYJB05)、刘耀院士专项(2016-ZZ-01)资助

杨瑞琴、女、1971年生、中国人民公安大学刑事科学技术学院教授 e-mail：rqyang1971@yahoo.com

O657.3

A

10.3964/j.issn.1000-0593(2016)12-4017-04