近红外光谱技术结合化学计量学快速测定杜仲中松脂素二葡萄糖苷和京尼平苷酸的含量

李方飞、彭应枝、许雄博、资 文、刘 蕊、刘 韶*

1. 中南大学湘雅医院药学部、湖南 长沙 410008 2. 中南大学药学院、湖南 长沙 410013

近红外光谱技术结合化学计量学快速测定杜仲中松脂素二葡萄糖苷和京尼平苷酸的含量

李方飞1,2、彭应枝1,2、许雄博1,2、资 文1,2、刘 蕊1,2、刘 韶1,2*

1. 中南大学湘雅医院药学部、湖南 长沙 410008 2. 中南大学药学院、湖南 长沙 410013

应用近红外光谱技术并结合化学计量学建立杜仲中松脂素二葡萄糖苷(PDG)和京尼平苷酸(GPA)含量测定模型。以积分球漫反射方式采集近红外光谱数据、应用一阶微分、多元散射校正(MSC)等优选光谱数据预处理方法和竞争自适应加权采样(CARS)筛选最优波长变量、采用偏最小二乘法(PLS)和交叉验证法建立PDG和GPA的定标模型。PDG和GPA的定标模型显示出良好的预测效果、其校正集的相关系数分别为0.961 5和0.958 3、交互验证均方差分别为0.001 5和0.006 4。表明此快速预测模型准确可靠、适合快速测定杜仲中的PDG和GPA、为杜仲质量控制在线化提供了新思路。

近红外光谱； 偏最小二乘法； 杜仲； 松脂素二葡萄糖苷； 京尼平苷酸

引 言

杜仲(Eucommiaulmoides)属于杜仲科杜仲属、是我国特有的二级保护植物[1]。中药杜仲传统取其干燥树皮入药、具有补肝肾、强筋骨、降血糖、调血脂、安胎的功效[2-4]。

《中国药典》2015年版一部中松脂素二葡萄糖苷(PDG)为杜仲皮中的质量控制指标、含量测定采用高效液相色谱法(HPLC)[4]、但该方法处理过程繁琐、费时、仅适合实验室分析、不能满足实时与在线分析需求[5]。近年来、由于近红外光谱(NIRS)快速、无损和环保等优点、在农业、食品及医药等领域的应用日益广泛[6-11]。

目前、将近红外光谱技术应用于杜仲中PDG的含量测定虽然已有报道[5,12]、但存在样本量较少、缺乏代表性； 未对偏最小二乘法(PLS)建立的PDG定标模型进行说明等缺陷。本实验收集了45批更多产地的杜仲样本、采用高效液相色谱法(HPLC)测定杜仲中2个主要活性化合物—PDG、京尼平苷酸(GPA)的含量并利用近红外光谱技术探究含量与其光谱数据之间的相关性、采用PLS法构建NIRS定量分析模型、以达到快速测定杜仲中PDG和GPA含量的目的、为杜仲的质量控制提供新的参考。

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

ANTARIS Ⅱ傅里叶变换近红外光谱仪(美国Thermo Fisher公司)及随机附带的Results光谱采集软件； 高效液相色谱仪(美国安捷伦科技有限公司)、Welch Materials C18色谱柱(4.6 mm×250 mm、5 μm、美国Welch公司)。

杜仲药材来自中国13个省份、各批次药材经刘韶教授(中南大学湘雅医院药学部)鉴定为杜仲科植物杜仲(Eucommiaulmoides)的树皮。

1.2 HPLC数据测定

HPLC数据测定。色谱柱：Welch Ultimate XB-Cl8； 检测波长230 nm； 流速1.0 mL·min-1； 流动相：甲醇(A)-0.2%H3PO4溶液(B)； 柱温：35 ℃； 进样量：6 μL。每个样品测定3次、取平均值。

1.3 近红外光谱数据采集

1.3.1 扫描条件

扫描范围：10 000～4 000 cm-1、分辨率：8 cm-1、扫描次数：32次。参比光谱为仪器内置背景、谱图采集方式为积分球漫反射。

1.3.2 光谱采集

采用文献[5]方法将杜仲样本粉碎、干燥、冷却后备用、称取2 g左右杜仲粉末置于光谱仪样品盘中、轻轻压实、每个样品平行装样并测定3次、取光谱平均值。

2 结果与分析

2.1 杜仲活性成分测定结果

采用HPLC法作为标准方法测定杜仲样本集中PDG和GPA的含量、结果如表1所示。

表1 杜仲中活性成分测量结果

2.2 杜仲样品的近红外光谱

如图1所示、杜仲的原始光谱特性相似、在波数范围10 000～4 000 cm-1内(图中横坐标的1到1 557)、近红外谱图所含信息量丰富、故在此区间进行杜仲定量分析。谱图中明显存在异常光谱、采用基于蒙特卡洛交互验证法[13]判断样本集中的异常样品并将其筛除、结果如图2。

图1 杜仲样本近红外原始光谱图

图2 筛除异常样品结果图

2.3 光谱预处理方法的选择

近红外光谱信息中一些不相关的信息和噪声将很大程度上影响最终预测模型的准确性与稳定性、需对近红外光谱进行预处理。本研究首先选取三种基本方法对光谱进行预处理、包括一阶微分、多元散射校正(MSC)和中心化、如图3所示、经这三种预处理方法处理后的光谱图噪音仍较大、因此需对光谱进行进一步处理。如表2所示、经SG平滑+正交信号校正(OSC)对光谱进一步处理后、PDG和GPA预测模型的交互验证均方差(RSMECV)有明显提高、RSMECV分别达到0.001 5和0.006 4。综合以上、最终确定PDG和GPA含量预测模型的最佳预处理方法为一阶微分+MSC+中心化+OSC+SG平滑。

图3 PDG、GPA经一阶微分+MSC+均值中心化预处理后的光谱图

表2 不同光谱处理方法获得杜仲中活性成分定量模型参数

2.4 最佳建模主因子数

最佳建模主因子数的选择可直接关系到最终预测模型的准确度。“过拟合”与“欠拟合”现象是由于主因子数选择不当导致的、并均可使预测误差显著增大[14]。本实验采用内部交叉验证方法[15]确定最佳建模主因子数。图4为PDG和GPA的RMSECV随主因子数的变化图、RMSECV最小时的主因子数即为最佳建模主因子数。如图中箭头所示、最终确定PDG和GPA预测模型的建模主因子数分别为8和6。

2.5 波长变量的选择

优选波长变量、筛除冗余干扰波长可明显提高模型预测能力与稳定性。本实验采用竞争自适应加权采样(CARS)[16]筛选模型中有效波长变量、剔除冗余波长变量、根据RMSECV最小原则确定最优波长组合。图5为PDG和GPA的RMSECV随各变量回归系数的变化图、如图5所示、PDG和GPA模型分别保留18和21个波长变量。

2.6 定量校正模型的建立与体外验证

依照上述最优条件建立杜仲中PDG和GPA的定量分析模型、通过验证发现PDG和GPA的定量分析模型预测值与HPLC测量值均具有很好的相关性、表明两个校正模型均具有较好的预测准确度。结果见图6。随机抽取6份未知样本组成验证集、分别采用HPLC法和已建立的定量分析模型预测PDG和GPA的含量、将测量值与预测值进行比较、结果见表3。总体而言、PLS模型预测值与HPLC法测量值无显著性差异。

图4 PDG和GPA近红外定量模型的交互验证结果

图5 PDG和GPA定量模型波长变量的回归系数图

图6 PDG和GPA真实值和预测值的相关性

表3 HPLC法测定值与近红外预测值比较

3 结 论

将近红外光谱技术与化学计量学方法相结合、采用PLS建立了杜仲药材中PDG和GPA近红外含量测定模型、实现了对PDG和GPA两种成分的快速分析、为杜仲质量控制及在线监测提供了参考思路。本研究中杜仲的另2个主要活性化合物—绿原酸(CHA)和京尼平苷(GP)未获得对应的NIRS定量分析模型、具体原因是本研究杜仲样本来源广泛、质量良莠不齐、活性成分含量差异大、仅有15%杜仲样本的CHA含量达到0.1%、不满足近红外应用条件； GP NIRS定量分析模型的RMSECV较大、GP模型预测效果较差。在后期研究中将进一步收集最具代表性的杜仲样本、建立杜仲CHA和GP的定量分析模型、并更新已有的PDG和GPA的定量分析模型、达到杜仲四种活性成分同时检测的目的。

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*Corresponding author

Rapid Determination of Pinoresinol Diglucoside and Geniposidic Acid inEucommiaulmoideswith Near Infrared Spectroscopy Combined with Chemometrics Methods

LI Fang-fei1,2,PENG Ying-zhi1,2,XU Xiong-bo1,2,ZI Wen1,2,LIU Rui1,2,LIU Shao1,2*

1. Xiangya Hospital,Central South University,Changsha 410008,China 2. School of Pharmaceutical Sciences,Central South University,Changsha 410013,China

To develop a quantitative models for simultaneous determination of pinoresinol diglucoside (PDG) and geniposidic acid (GPA) inEucommiaulmoideswith near-infrared (NIR) spectroscopy combined with chemometrics. The NIR spectra were collected in diffuse reflection mode and pretreated with various spectra preprocessing methods including first-order differentiator,multiplicative scatter correction and so on. The optimal wavelength variables were screened out by competition adaptive weighted sampling method. The quantitative models for the simultaneous determination of PDG and GPA inEucommiaulmoideswere established with partial least squares (PLS) algorithm and cross validation methods. The quantitative prediction models for simultaneous determination of PDG and GPA inEucommiaulmoidesshowed good predictive ability. The correlation coefficients (R2) of the two calibration models were 0.961 5,0.958 3 while the roots mean square of cross-validation (RMSECV) were 0.001 5,0.006 4,respectively. The quantitative prediction models proved that near infrared spectra method used for the quantitative analysis of PDG and GPA inEucommiaulmoidesowned high prediction accuracy and can meet the precision need of rapid determinations of PDG and GPA inEucommiaulmoidesin reality so t it provides a new method to realize the real time on line of quality control ofEucommiaulmoides.

Near infrared spectroscopy; Partial least squares;Eucommiaulmoides; Pinoresinol diglucoside; Geniposidic acid

Apr. 26,2015; accepted Aug. 8,2015)

2015-04-26、

2015-08-08

国家“十二五”科技支撑计划项目(2011BAI01B08)资助

李方飞 、1990年生、中南大学药学院硕士研究生 e-mail：281523604@qq.com *通讯联系人 e-mail：liushao999@hotmail.com

R927.2

A

10.3964/j.issn.1000-0593(2016)12-3945-06