慢性移植肾病外周血Th17细胞及其因子变化的意义

陕西省人民医院肾移植科(西安710068)

张蓬杰　张志明△　石斌娅　杜　鹏　 段　斌　陈　瑞　孙建国



慢性移植肾病外周血Th17细胞及其因子变化的意义

陕西省人民医院肾移植科(西安710068)

张蓬杰张志明△石斌娅杜鹏 段斌陈瑞孙建国

摘要目的：探讨外周血CD4+Th17/CD4+T 比率及IL- 17、IL-6与IL-23在慢性移植肾肾病患者中的变化及意义。方法：使用流式细胞术检测慢性移植肾肾病、移植肾功能正常以及未行肾移植的慢性肾功能不全尿毒症期和健康人四组人群中Th17细胞及其相关因子。结果：CAN患者组CD4+Th17/CD4+T比率为3.96±0.28%，血清IL-17、IL-6与IL-23分别为：273.12±17.62pg/ml， 231.52±45.32pg/ml，548.79±15.25 pg/ml；移植肾功正常组：CD4+Th17/CD4+T比率为2.47±0.25%，血清IL-17、IL-6与IL-23分别为142.32±10.15pg/ml，157.26±8.17pg/ml，251.20±13.28pg/ml；尿毒症组：CD4+Th17/CD4+T比率为1.48±0.29%，血清IL-17、IL-6与IL-23分别为44.52±6.12 pg/ml，67.38±10.38pg/ml，35.43±9.32pg/ml；健康组：CD4+Th17/CD4+T比率为1.59±0.31，血清IL-17、IL-6与IL-23分别为36.87±8.14 pg/ml，60.28±8.72 pg/ml，38.15±8.56 pg/ml。 移植肾病组指标明显高于移植肾功能正常组(P<0.05)，接受移植组较未行移植组各指标均明细升高(P<0.05)，而未移植尿毒症组与健康组各指标无明显差别(P>0.05)。结论：移植后患者CD4+Th17/CD4+T比率及细胞因子表达均升高；CAN组较移植肾功能正常组外周血CD4+Th17/CD4+T比率及细胞因子表达升高更为明显；未接受移植两组间CD4+Th17/CD4+T比率及细胞因子变化不明显。

主题词肾移植肾病/血液白细胞介素17/代谢白细胞介素6/代谢

慢性移植肾肾病(Chronic allograft nephropathy，CAN)是指肾移植3个月后出现移植肾功能进行性减退,常伴有高血压、蛋白尿等[1]。早期进行移植肾活检即便已经发现移植物进入慢性肾病，但很难从病理演变判断其发生的具体原因[2]。近年来研究表明：CD4+IL-17+辅助性T细胞( Th17细胞)及其细胞因子在机体调节免疫中起重要作用[3]。现就Th17细胞及其相关细胞因子在CAN患者发病机制中的作用进行探讨。

资料与方法

1一般资料随机选择我科肾移植患者94例，其中慢性移植肾肾病组(CAN组)28例，为同种异体肾移植术后2年以上，血肌酐介于200～400μmol/L，未进行透析治疗的CAN患者；移植肾功能正常组(Normaltransplantation kidney，NTK) 35例，为同种异体肾移植术后2年以上、血肌酐正常；疾病对照组(CRF组) 31例，为慢性肾功能不全 (Chronic renal function,CRF)患者，血Cr为350～550μmol/L，也未行血液透析治疗；另外选择健康体检者28例为健康对照组(Normal subjects,NC)。CAN组入选标准：①男、女不限，年龄18～55岁，原发病为慢性肾小球肾炎致慢性肾功能不全-尿毒症期，术前受者无明显感染及急慢性肝炎等；②HLA基因配型良好，HLA错配位点均在2个以内；③受者术前术后治疗基本相同，术后应用甲基泼尼松龙治疗，维持期治疗应用他克莫司(FK506)+麦考吗替酚酸酯(MMF)+强的松(Pred)；④术后受者未出现过急性排斥反应或严重感染等。 通过临床和病理检查相结合的方法明确诊断，并依据诊断标准分组。

2CAN诊断标准CAN病例按照临床及病理相结合的标准进行诊断。①临床标准：术后3个月出现高血压，B超检查排除血管性因素，尿蛋白阳性，并逐渐增多；化验血清肌酐及尿素氮升高，肾功能进行性减退；除外其它造成移植肾功能下降的原因；移植肾B超检查提示：移植肾实质结构紊乱，皮质血流稀少，阻力指数略升高，移植肾体积缩小等。②病理标准：根据移植肾病理检查的纤维化程度和Banff05标准对移植肾病理标本进行分期，Banff I期以上诊断为CAN。

3检测方法

3.1四组患者晨起空腹分别取静脉血约4ml，置于肝素钠抗凝真空采血管中，充分混匀，常温下保存，一部分离心后取血清保存于-20℃低温冰箱中备用，供ELISA 法检测细胞因子IL-17、IL-6、IL-23；另一部分在2 h内提取外周血单个核细胞( PBMC)，应用流式细胞技术检测外周血中CD4+IL-17+辅助性T细胞。

3.2CD4-PC5抗体、PE-IL-17A抗体及相应的对照抗体APC-IgG1、核内染色用固定破膜剂购自北京达科为生物技术有限公司。PMA、离子霉素、莫能霉素、人淋巴细胞分离液购自Sigma公司。人IL-17、IL-6、IL-23 试剂盒购自上海武昊经贸有限公司。

3.3标本的收集与处理：收集清晨空腹静脉血4ml肝素抗凝，一部分800r/min离心10 min后取血清冻存于-20℃冰箱以检测IL-17、IL-6、IL-23。另一部分应用淋巴细胞分离液处理后行外周血CD4+T淋巴细胞分离：上述抗凝血Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞( PBMC )，操作按试剂盒说明进行, 应用免疫磁珠法分离外周血CD4+T淋巴细胞, 锥虫蓝染色判定细胞活力> 95%, 流式细胞术检测细胞纯度> 97%。

3.4流式细胞术检测Th17细胞：取PBMC悬液接种于24孔板，每孔接种1ml，加入刺激剂PMA20ng/ml，离子霉素1μg/ml，莫能霉素10μl/ml，370C，5%CO2，孵育4h。收集细胞后调整浓度为1×107/ml。取PBMC悬液100ul加入CD4-PC5抗体，阴性对照管加入Ig G1-PC5抗体，室温避光孵育30min，PBS洗涤1次。然后加入固定剂4%多聚甲醛避光静置5min。之后加入破膜剂0.5ml，室温避光10min，PBS洗涤1次后弃上清。加入胞内抗体IL-17-PE，对照管加入同型对照，4℃避光染色30min。PBS洗涤2次后在CXP软件下获取1万个细胞，应用Becman Coulter FC 500流式细胞仪分析。

3.5血清IL-17、IL-6、IL-23检测应用双抗体夹心(ELISA)法，严格按照试剂盒操作说明书进行操作。

4统计学处理本研究应用SPSS10.0对所有数据进行处理，采用单因素方差分析(One-Way Anova)，以P<0.05为有显著性差异，P<0.01为有极显著性差异。

结果

1患者一般情况比较随机选择的4组患者及体检者在样本量大小、性别分布、年龄分布、原发病种类无显著性差异(P>0.05)，CAN组和NTK组在移植时HLA位点错配率无显著性差异(P>0.05)，术后应用免疫抑制诱导药物一致，免疫抑制维持治疗为同一药物浓度的他克莫司。

2四组CD4+Th17/CD4+T淋巴细胞比率比较见附表。肾移植手术后，无论移植肾功能是否正常，CD4+Th17/CD4+比率较未行肾移植者均明显升高(P<0.05)。对于肾移植受者，发生慢性移植肾肾病的受者其比率较移植肾功正常者升高更为明显(P<0.05)；而对于未行肾移植患者，尿毒症患者的CD4+Th17/CD4+比率与正常对照组无明显差异(P>0.05)，提示CD4+Th17/CD4+比率的变化与尿毒症状态关系不大。

3各组IL-6、IL-23、IL-17细胞因子比较见附表。CAN组较NTK组细胞因子水平明显升高(P<0.05)；且移植两组较未移植组细胞因子水平也明显升高(P<0.05)；未移植组间细胞因子水平变化无显著性差异(P>0.05)。提示尿毒症状态对Th17细胞因子变化影响不大。

附表　四组间CD4+IL-17/CD4+细胞比率及相关细胞因子在外周血中的比较±s)

注：CAN组与NC组比较,P<0.05；与CRF组比较,P<0.05；与NTK组比较, P<0.05

讨论

肾移植手术做为尿毒症患者的最佳治疗方法，移植后早期肾功能已显著改善，患者生活质量明显提高，但远期效果并不理想，移植肾的平均寿期仍徘徊在10年左右，最终大多患者将再次面临血液透析来维持生命，导致移植肾失去功能的主要原因是CAN[4]。常见原因主要有免疫和非免疫因素，免疫因素包括术后的急、慢性排斥反应及发生频率、病理类型、严重程度、HLA配型等；非免疫因素包括钙调神经蛋白阻滞剂(CNI)肾毒性、反复病毒感染、术后血糖异常、高血压病、脂代谢异常等影响[5]。同时供、受者性别不同、年龄差距、体重差异和供肾摘取方式以及冷、热缺血时间的长短、术后早期是否发生急性肾小管坏死都与CAN 的发生有关。移植肾穿刺病理检查表现为：肾动脉内膜增厚、管腔阻塞、缺血性肾小球改变、移植肾小球病、肾小管萎缩、间质纤维化和间质巨噬细胞和淋巴细胞浸润等改变[2]。但这些病理改变都是非特异性的，单纯从病理变化很难判断其发生的具体原因。由于没有特异性的免疫学指标进行监测，大多数病人在移植肾功能已经损害严重，出现大量蛋白尿或血清肌酐明显升高时才会进行诊断，而此时，即便给以相关治疗移植肾功能大多难以恢复[6,7]。那么，我们能否找到一个CAN发生早期的免疫学指标呢？

Th17细胞是近年新定义的一类CD4+T细胞亚群[8,9]。是初始CD4+T细胞活化后在TGF-β和IL-6的作用下分化生成，并通过分泌IL-17来诱导多种前炎性细胞因子(IL-17、IL-23、IL-6)和趋化因子[10,11]的产生，这些细胞因子能够募集及活化中性粒细胞，参与机体炎症反应，抑制免疫耐受的产生，在自身免疫性疾病、肿瘤及感染等疾病中发挥重要作用[12]。Th17细胞能产生多种效应因子，其中最重要的效应因子是IL-17[13]，其受体在体内表达广泛。IL-17具有促进炎症反应，诱导细胞因子(如IL-6、TNF)、趋化因子(如MCP1和MIP2)和基质金属蛋白酶的表达，引起组织细胞浸润和破坏[12]。IL-17与IL-23具有协同作用，可以增强炎症反应并造成组织炎性损伤。Th17细胞已被证实与自身免疫性疾病关系密切[14]。在多种自身免疫性疾病，如：类风湿性关节炎、多发性硬化症、系统性红斑狼疮、以及哮喘等患者的血清及组织中IL-17高表达[15～17]。 CD4+IL-17辅助性T细胞及其相关因子的变化在其它系统疾病中研究相对较多，且结论明确。但对于慢性移植肾肾病的研究国内尚未见报道，国外文献资料也相对较少。本研究就Th17细胞及其细胞因子在CAN患者发病机制中的作用进行探讨，意在寻求CAN早期的免疫学指标，为早期发现和预防CAN的发生提供依据，从而为肾移植受者的长期存活提供有效的帮助。

该研究通过流式细胞技术和ELISA方法监测CAN患者外周血中CD4+IL-17+辅助性T细胞和其相关因子的变化规律。结果发现：经历肾移植后，无论移植肾功正常与否，CD4+IL-17/CD4+比率均较未行肾移植患者明显升高。对于肾移植受者，发生慢性移植肾肾病后其比率较移植肾功正常者升高更为明显。对于未行肾移植者，尿毒症患者的CD4+IL-17/CD4+比率与正常对照组无明显差异，表明CD4+Th17变化与尿毒症状态无关。细胞因子IL-6、IL-23、IL-17各组间的比较结果与上述变化相近，即：经历肾移植后，CAN组较NTK组细胞因子水平明显升高。且移植两组较未移植组细胞因子水平也明显升高。未移植组间细胞因子水平变化无显著性差异。对于CD4+Th17/CD4+比率及细胞因子IL-6、IL-23、IL-17在四组患者中的变化可以推断：患者经历肾移植后，不管移植肾功能如何，均出现了Th17细胞和相关因子的增加，考虑与置入同种异体肾脏有关，外源性抗原刺激机体，产生一系列免疫反应，促进了Th17细胞的产生活化，并分泌相关细胞因子。不过，CAN组较NTK组升高更明显，说明存在其它因素导致Th17细胞增生及相关因子分泌更为明显，这些因素不但包括了免疫学因素，还包括了非免疫学因素的影响，非免疫学因素对Th17的影响机制我们仍不明确。由此可见，CAN的发生并非一个独立因素，而是一个复杂的过程。再之，是否可以将CD4+Th17/CD4+比率及细胞因子的变化做为CAN诊断的依据？升高到多少才能作为诊断为慢性移植物肾病的阈值，目前无法确定，因为本次研究病例量较少，还需要进一步大样本研究。

结合本研究初步发现：接受肾移植后患者外周血中CD4+IL-17细胞数量增加、细胞因子表达增加；发生慢性移植肾病后CD4+IL-17细胞及细胞因子表达增加且更为明显，提示Th17细胞及相关细胞因子在CAN的发生中具有一定意义。但外周血Th17细胞及其细胞因子做为慢性移植物肾病的早期预测指标尚需更多的工作。

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(收稿：2015-06-20)

Changes of peripheral blood CD4+helper T cells and the related cytokines expression at the chronic allograft nephropathy

Department of Kidney Transplantation, Shaanxi Provincial People,s Hospital

(Xi，an 710068)Zhang PengjieZhang ZhimingShi Binyaet al

ABSTRACTObjective： To investigate the changes of CD4+helper T cells (Th17cells) and the related cytokines expression in the peripheral blood at the chronic allograft nephropathy (CAN) after kidney transplantation. Methods ：Thirty patients with CAN were examined for CD4+Th17/CD4+T ratio in the peripheral blood using the flow cytometry,IL-17,IL-6 and IL-23 levels in plasma of these subjects were measured by enzyme- linked mimunoadsorbent assay. and the data were compared with those of thirty-five kidney recipients with normal graft function, thirty-three patients with chronic renal function (CRF), and twenty-five normal subjects. All the recipients had no more than 2 HLA mismatch and received the same inductive and maintenance drug treatment. Results： The recipients with CAN had significantly higher CD4+Th17/CD4+T ratio and the related cytokines IL-17,IL-6 and IL-23 expression compared with those with normal graft function (3.96±0.28 vs 2.47±0.25 and 273.12±17.62 vs 142.32±10.15, 231.52±45.32 vs 157.26±8.17, 548.79±15.25 vs 251.20±13.28, P<0.05). The recipients whatever they had normal renal graft function showed significant difference in CD4+Th17/CD4+T ratio and the related cytokines IL-17,IL-6 and IL-23 expression from the patients with CRF (1.48±0.29 and 44.52±6.12 67.38±10.38 35.43±9.32) and the normal control subjects(1.59±0.31 and 36.87±8.14 60.28±8.72 38.15±8.56). The patiengts with CRF had no difference in CD4+Th17/CD4+T ratio and the related cytokines from the normal control subjects. Conclusion：The peripheral blood CD4+Th17/CD4+T ratio and the related cytokines IL-17、IL-6 and IL-23 expression in the kidney recipients with CAN are significantly higher than those of recipients with normal renal graft function, which does correlate with elevated creatinine level, suggesting a role of Th17and the related cytokines in the occurrence and development of CAN.

KEY WORDSKidney transplantationNephrosis/bloodInterleukin-17/metabolism Interleukin-6/metabolism

【中图分类号】R692

【文献标识码】A

doi：10.3969/j.issn.1000-7377.2016.01.042

△ 西安市中心医院检验科