MiR-711-Sp1信号通路参与心肌梗死后心脏纤维化动态变化*

陕西省人民医院心内科(西安710068)

赵　娜　张　勇　刘小军　刘仲伟　潘　硕　夏东雨　徐姣姣　于海奕△　徐　明△　高　炜△▲



MiR-711-Sp1信号通路参与心肌梗死后心脏纤维化动态变化*

陕西省人民医院心内科(西安710068)

赵娜张勇刘小军刘仲伟潘硕夏东雨徐姣姣于海奕△徐明△高炜△▲

摘要目的：探讨心肌梗死后不同时相梗死区及梗死周边区，miR-711-Sp1通路表达谱与心脏纤维化病理过程的相关性。方法：采用结扎大鼠冠状动脉左前降支方法制作大鼠心肌梗死模型，Real-time PCR法评价大鼠心脏miR-711表达水平；采用Western blot方法评价大鼠心脏Sp1蛋白表达水平；应用天狼猩红染色评价心脏纤维化病理改变。结果：大鼠心肌梗死后2d，梗死区miR-711表达无明显变化，Sp1表达下调，纤维组织减少；梗死周边区miR-711表达显著上调(P<0.01)，Sp1表达无明显变化，纤维组织无明显变化。梗死后7d，梗死区miR-711表达显著下调(P<0.01)，Sp1表达回升至对照水平，纤维组织开始增加；梗死周边区miR-711表达回降至对照水平，Sp1表达无明显变化，纤维组织增加不明显。梗死后14d，miR-711表达显著下调(P<0.01)，Sp1表达显著上调(P<0.01)，纤维组织明显增多；梗死周边区miR-711表达显著下调(P<0.05)，Sp1表达显著上调(P<0.01)，纤维组织沉积显著增加。结论：大鼠心肌梗死后不同区域不同时相，miR-711-Sp1及纤维化表达呈动态相关表达。

主题词心肌梗塞/病理学转录因子Sp1/代谢核糖核苷酸类/代谢 @miR-711

心脏间质纤维化是心肌梗死后心脏重塑的重要病理过程之一，参与了心肌收缩力受损及泵功能衰竭过程[1]。目前已有研究发现:心肌梗死后早期梗死区域纤维化为有利病理过程，有利于瘢痕组织愈合，防止心室破裂；心肌梗死后晚期梗死周边区纤维化为不利病理过程，促进心脏重塑，致心脏顺应性下降，导致心衰发生发展[2]。因此，识别心肌梗死后有利心脏纤维化向不利心脏纤维化发生发展时期而进行干预，将更有利于心脏结构及功能的保留。

近些年，大量miRNAs被发现在心脏纤维化中发挥调节作用，成为一种新的心脏病理变化调节模式[3～6]。我们前期工作亦发现miR-711通过其靶基因Sp1在心肌梗死后28d参与抑制心脏纤维化病理过程[7]，为进一步探讨能否将miR-711-Sp1通路作为靶点从而实现对心肌梗死后不同时相的纤维化病理过程进行干预以改善预后，本研究将阐明：①心肌梗死后不同时相梗死区及梗死周边区，miR-711-Sp1通路表达谱变化；②心肌梗死后不同时相梗死区及梗死周边区，miR-711-Sp1通路表达谱变化与心脏纤维化病理过程的相关性。

材料与方法

1动物模型制备8周龄雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠, 体重180～220 g，购自北京大学医学部实验动物中心。实验过程中应用戊巴比妥钠(50 mg/kg, 腹腔内注射)麻醉。本研究采用冠状动脉左前降支(Left anterior descending artery，LAD)结扎手术制备心肌梗死模型[8]。假手术组除不予以丝线结扎冠状动脉左前降支外, 其余手术步骤与手术组相同。SD大鼠分别给予心肌梗死手术以及假手术处理。分别于处理后第2天，第7天及第14天,分离获取心脏梗死区及梗死周边区标本,部分心肌组织置于4%(质量体积比)多聚甲醛溶液中, 其余心肌组织置入冻存管冻存于液氮中。

2组织学染色分离部分心室肌组织, 置于4%多聚甲醛后, 经进一步脱水, 石蜡包埋后, 进行天狼猩红染色观察心脏间质纤维化。

3实时荧光定量聚合酶链反应(Real time- QPCR)应用miRcute miRNA分离提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司, 中国)提取分离小分子RNA(小于200个碱基)。MiRcute microRNA cDNA合成试剂盒及实时荧光定量PCR检测试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)用于microRNA表达分析。实时荧光定量PCR采用ABI PRISM 7700检测系统完成。MiR-711引物序列为:GGGACCCTGGGAGAGATGTAAG；内参5S引物序列为: GTCTACGGCCATACCACCCTGAAC。

4Western blot应用RIPA裂解液(全新拓达科技有限公司, 北京), 添加苯甲基磺酰氟(PMSF, 1 mmol/L)提取组织或细胞总蛋白。蛋白浓度定量采用BCA蛋白定量法(普利莱, 北京)。样品应用10%SDS聚丙烯酰胺凝胶分离, 转移至硝酸纤维素膜, 在5%脱脂牛奶中封闭1 h, 分别应用抗-Sp1及抗eIF5抗体(Santa Cruz, CA, USA)孵育, 4℃, 过夜。洗膜后, 室温下, 采用辣根过氧化物酶标记的二抗孵育1 h。采用化学发光法使条带显影, 显影图像利用光密度法定量， EIF5蛋白水平用作内参校正蛋白量。

结果

1大鼠心肌梗死后不同时相不同区域miR-711表达谱应用Real-time PCR分别检测大鼠心肌梗死后不同时相梗死区及梗死周边区域miR-711表达水平。图1A显示：在梗死区域梗死后2d，miR-711表达量无明显变化，梗死后7d及14d，miR-711表达量均显著下降(P<0.01，P<0.01)；图1B显示：在梗死周边区，梗死后2d， miR-711表达量显著增高(P<0.01)，梗死后7d，miR-711表达量无明显变化，梗死后14d，miR-711表达量显著降低(P<0.05)。

2大鼠心肌梗死后不同时相不同区域Sp1表达谱应用Western blot分别检测大鼠心肌梗死后不同时相梗死区及梗死周边区域Sp1表达水平。图2A显示：在梗死区域，梗死后2d，Sp1表达量显著下调(P<0.01)，梗死后7d，Sp1表达量无显著变化，梗死后14d，Sp1表达量显著上调(P<0.01)；图2B显示：在梗死周边区，梗死后2d及7d， Sp1表达量无显著变化，梗死后14d，Sp1表达量亦显著上调(P<0.01)。

3大鼠心肌梗死后不同时相不同区域纤维化表现采用天狼猩红染色评价心脏胶原沉积程度(图3)。结果显示：梗死区，梗死后2d，胶原沉积显著减少, 梗死后7d及14d，胶原沉积均显著增加(见图3A)；梗死周边区，梗死后2d，胶原沉积无明显变化，梗死后7d，胶原沉积逐渐增加，梗死后14d，胶原沉积显著增加(见图3B)。

讨论

心脏重塑所致的心脏结构变化是心力衰竭发生发展的重要病理变化。现有大量研究已经认识到心肌梗死后的梗死区和非梗死区均有纤维化的沉积，并且这种不同区域的间质纤维化以时间依赖性方式发生[9～11]。由此推断决定心肌纤维化的分子机制变化可能在心肌梗死后不同时相，心室不同区域均不同。阐明心肌梗死后纤维化的分子机制有可能找到特定的治疗靶点，既能促进创伤愈合反应，也能减弱梗死扩展和心脏衰竭的心脏重塑不利因素。

我们前期研究发现miR-711负向调控靶基因Sp1参与抑制心肌梗死后晚期心肌纤维化病理过程。本研究进一步探讨了miR-711在心肌梗死后不同时相，不同区域的表达。结果发现：在心肌梗死后2d，梗死区miR-711表达无明显变化；在心肌梗死后7d及14d，梗死区miR-711表达下调，有利于梗死区局部胶原纤维沉积，瘢痕组织形成，抑制梗死区的扩展；而在梗死周边区，2d时，miR-711表达明显增高，推测是心肌梗死周边区纤维化开始时miR-711呈现对抗性增加，抑制梗死周边区纤维化，防止梗死区扩展；当梗死后7d，miR-711表达下降至正常对照水平，此时梗死周边区有胶原纤维沉积，梗死后14d，miR-711表达显著下调时，梗死周边区胶原纤维显著增加，揭示miR-711可能是抑制梗死周边区心脏纤维化的有利因素之一。

此外，为进一步证实miR-711-Sp1动态变化与心肌梗死后心脏纤维化动态演变相关。我们分别检测了梗死区及梗死周边区Sp1表达，Sp1是已被我们前期证实的miR-711靶分子[7]。目前研究已经明确Sp1参与纤维化病理过程[12～14]。在梗死区2d时，Sp1表达量显著下调，与梗死区2d时胶原组织大量降解相对应，此时miR-711表达量无明显变化，推测此时Sp1的变化可能还受到其他调控分子的影响，如血管紧张素II，转化生长因子-β[15, 16]；在梗死后7d，梗死区Sp1较前明显增加至对照水平，此时miR-711表达量下调，当梗死后14d，Sp1表达量进一步显著增多时，miR-711表达量明显下调，梗死区胶原纤维亦明显增加，提示miR-711- Sp1通路动态演变与心梗后梗死区域纤维化的动态演变相关；同样，在梗死周边区，梗死后2d及7d，Sp1表达量均无明显变化，梗死后14d，Sp1表达量亦显著增加，此时梗死周边区也有胶原纤维大量聚集，进一步明确Sp1与梗死周边区纤维化亦密切相关。上述结果显示在大鼠心肌梗死后2d，梗死区尚处于细胞坏死，胶原降解状态，梗死周边区尚未出现胶原沉积增加时，干预促使miR-711上调有可能缓解心脏瘢痕修复，致使心脏破裂的风险增加。当大鼠心肌梗死后7d，梗死区胶原沉积时，梗死周边区miR-711表达呈正常对照水平，尚未开始下调，心肌梗死后14d，梗死区胶原大量沉积时，梗死周边区miR-711表达出现显著下调，此时梗死周边区胶原组织亦开始出现较多沉积。因此，本实验结果提示对大鼠心肌梗死后miR-711的上调干预延迟至7d之后14d之前，既能降低梗死区心室破裂风险，又可抑制梗死周边区域心脏重塑，缓解心脏重塑的发生。但对于心肌梗死后研究miR-711具体的干预时机，或者开发一种特定针对梗死区或梗死周边区的新干预模式仍有待于进一步深入研究。

在我们前期工作发现：miR-711-Sp1通路参与心肌梗死后心脏纤维化病理过程的基础之上，本研究对miR-711，Sp1及胶原组织在心肌梗死后不同时相心脏不同区域进行检测，发现三者在心肌梗死后不同时相不同区域的表达均呈动态变化，进一步证实了心肌梗死后纤维化是一个动态演变的病理过程，其早期为有利纤维化，晚期为不利纤维化。因此，未来研究通过深入明确心肌梗死后心脏纤维化分子机制将为平衡心肌梗死后有利纤维化与不利纤维化找到一个干预靶点提供更多线索。

参考文献

[1]Parikh A, Patel D, Mc-Tiernan CF, et al. Relaxin suppresses atrial fibrillation by reversing fibrosis and myocyte hypertrophy and increasing conduction velocity and sodium current in spontaneously hypertensive rat hearts[J]. Circ Res， 2013，113(3):313-321.

[2] Van-Den-Borne SW, Diez J, Blankesteijn WM, et al. Myocardial remodeling after infarction: the role of myofibroblasts[J]. Nat Rev Cardiol， 2010，7(1):30-37.

[3] Wang J, Huang W, Xu R, et al. Micro RNA-24 regulates cardiac fibrosis after myocardial infarction[J]. J Cell Mol Med， 2012，16(9):2150-2160.

[4]Liang H, Zhang C, Ban T, et al. A novel reciprocal loop between microRNA-21 and TGFβRIII is involved in cardiac fibrosis[J]. Int J Biochem Cell Biol， 2012，44(12):2152-2160.

[5] Bernardo BC, Gao XM, Winbanks CE, et al. Therapeutic inhibition of the miR-34 family attenuates pathological cardiac remodeling and improves heart function[J]. Proc Natl Acad Sci USA， 2012，109(43):17615-17620.

[6]Iekushi K, Seeger F, Assmus B, et al. Regulation of cardiac micro RNAs by bone marrow mononuclear cell therapy in myocardial infarction[J]. Circulation， 2012，125(14):1765-1773, S1-S7.

[7] Zhao N, Yu H, Yu H, et al. MiRNA-711-SP1-collagen-I pathway is involved in the anti-fibrotic effect of pioglitazone in myocardial infarction[J]. Sci China Life Sci ，2013，56(5):431-439.

[8] Cheng K, Malliaras K, Shen D, et al.Intramyocardial injection of platelet gel promotes endogenous repair and augments cardiac function in rats with myocardial infarction[J]. J Am Coll Cardiol， 2012，59(3):256-264.

[9] Mishra PK, Givvimani S, Chavali V, et al. Cardiac matrix: a clue for future therapy[J]. Biochim Biophys Acta, 2013,1832(12):2271-2276.

[10] Bax NA, Van-Marion MH, Shah B, et al. Matrix production and remodeling capacity of cardiomyocyte progenitor cells during in vitro differentiation[J]. J Mol Cell Cardiol， 2012，53(4):497-508.

[11] Siddesha JM, Valente AJ, Sakamuri SS, et al. Angiotensin II stimulates cardiac fibroblast migration via the differential regulation of matrixins and RECK [J]. J Mol Cell Cardiol， 2013，65(12):9-18.

[12] Li R, Xiao J, Qing X, et al. Sp1 Mediates a therapeutic role of MiR-7a/b in Angiotensin II-Induced Cardiac Fibrosis via Mechanism Involving the TGF-beta and MAPKs Pathways in Cardiac Fibroblasts[J]. PLoS One， 2015，10(4):e125513.

[13] Palumbo-Zerr K, Zerr P, Distler A, et al. Orphan nuclear receptor NR4A1 regulates transforming growth factor-beta signaling and fibrosis[J]. Nat Med， 2015，21(2):150-158.

[14] Siddesha JM, Valente AJ, Sakamuri SS, et al. Angiotensin II stimulates cardiac fibroblast migration via the differential regulation of matrixins and RECK[J]. J Mol Cell Cardiol， 2013，65(12):9-18.

[15] Vittal R, Mickler EA, Fisher AJ, et al. Type V collagen induced tolerance suppresses collagen deposition, TGF-beta and associated transcripts in pulmonary fibrosis[J]. PLoS One， 2013，8(10)：e76451.

[16]Wei LH, Huang XR, Zhang Y, et al. Deficiency of Smad7 enhances cardiac remodeling induced by angiotensin II infusion in a mouse model of hypertension[J]. PLoS One， 2013，8(7):e70195.

(收稿：2015-05-20)

MiRNA-711-Sp1 signal pathway is involved in the dynamic alteration of cardiac fibrosis after myocardial infarction

Department of Cardiovascular Medicine, People’s Hospital of Shaanxi Province

(Xi’an 710068)Zhao NaZhang YongLiu Xiaojunet al

ABSTRACTObjective: To explore the relation between the expression profile of miR-711-Sp1 pathway and cardiac fibrosis in the infarcted zone and border zone at different time after myocardial infarction. Methods: The myocardial infarction model was induced by ligation of left anterior descending coronary artery of rats. Using Real-time PCR evaluate the expression level of miR-711 in heart tissue of rats. Using Western blot evaluate the expression level of Sp1 protein in heart tissue of rats. Using Sirius red staining analyze the cardiac fibrosis. Results: At 2 days after myocardial infarction, in the infarcted zone, the expression of miR-711 did not alter, the expression of Sp1 down-regulated slightly, the fibrosis tissue reduced，in the border zone, the expression of miR-711 up-regulated significantly (P<0.01), the expression of Sp1 did not alter, the fibrosis tissue did not alter. At 7 days after myocardial infarction, in the infarcted zone, the expression of miR-711 down-regulated significantly (P<0.001), the expression of Sp1 up-regulated to the level of control, the fibrosis tissue got increased, in the border zone, the expression of miR-711 down-regulated to the level of control, the expression of Sp1 did not alter, the fibrosis tissue increased non-significantly. At 14 days after myocardial infarction, in the infarcted zone, the expression of miR-711 down-regulated significantly (P<0.001), the expression of Sp1 up-regulated significantly (P<0.01), the fibrosis tissue increased significantly, in the border zone, the expression of miR-711 down-regulated significantly (P<0.05), the expression of Sp1 up-regulated significantly (P<0.01), the fibrosis tissue increased significantly. Conclusion: At the different time and in the different zone after myocardial infarction, expression of miR-711-Sp1 pathway is related to the dynamic alteration of cardiac fibrosis.

KEY WORDSMyocardial infarction/pathologyTranscription factorSp1/metabolism Ribonucleotide/metabolism@ miR-711

【中图分类号】R542.22

【文献标识码】A

doi：10.3969/j.issn.1000-7377.2016.01.001

通讯作者▲

·论著·基础研究·

*国家自然科学青年基金资助项目(81400181)

△ 北京大学第三医院心内科