H2S对肠缺血-再灌注损伤大鼠凝血功能异常的影响

卢根林，吴爱兵，王宏宾（.义乌市中心医院 普通外一科，浙江 金华 000；.广东医学院附属医院 肿瘤中心，广东 湛江5808；.青海大学附属医院 肝胆胰外科，青海 西宁 8000）



H2S对肠缺血-再灌注损伤大鼠凝血功能异常的影响

卢根林1，吴爱兵2，王宏宾3
（1.义乌市中心医院 普通外一科，浙江 金华 322000；2.广东医学院附属医院 肿瘤中心，广东 湛江523808；3.青海大学附属医院 肝胆胰外科，青海 西宁 810001）

［摘 要］目的：H2S对肠缺血-再灌注损伤大鼠凝血功能异常的影响及机制。方法：24只雄性Wistar大鼠随机分为A（假手术）组、B（缺血-再灌注）组和C（缺血-再灌注+NaHS）组。建立大鼠肠缺血-再灌注损伤模型，再灌注前10 min C组大鼠经尾静脉注入100 μmol/kg NaHS并以1 mg/（kg·h）速度静脉维持到再灌注2 h。RT-PCR、流式细胞仪法分别检测单核细胞蛋白酶激活受体-1（PAR-1）、PAR-3 mRNA及蛋白表达；ELISA法检测血组织因子（TF）、TNF-α、组织型纤溶酶原激活物（t-PA）、纤溶酶原激活物抑制剂-1（PAI-1）；敏感硫电极法测定血H2S；检测凝血VIII因子活性（FVIII：C）、血管性血友病因子（vWF）、纤溶酶原活性（PLG：A）、抗凝血酶活性（AT：A）、血小板计数。结果：C组PAR-1、PAR-1 mRNA、TF、TNF-α、FVIII：C、vWF、t-PA、PAI-1均低于B组、高于A组，差异有统计学意义（均P＜0.01）；C组H2S、PLG：A、AT：A低于A组、高于B组，差异有统计学意义（均P＜0.01）。H2S与PAR-1、PAR-1 mRNA、TF、TNF-α、FVIII：C、vWF、t-PA、PAI-1呈负相关（r=-0.58、-0.68、-0.62、-0.64、-0.73、-0.55、-0.57、-0.64，均P＜0.01），与PLG：A、AT：A呈正相关（r=0.57、0.61，均P＜0.01）。结论：H2S通过降低PAR-1、TF、TNF-α含量，改善大鼠肠缺血-再灌注损伤时的凝血功能异常。

［关键词］肠缺血-再灌注损伤；硫化氢；凝血功能；大鼠

H2S由小肠组织胱硫醚-γ-裂解酶（CSE）催化L-半胱氨酸生成［1］，对肠缺血-再灌注损伤大鼠具有保护作用［1-2］，可改善肠缺血-再灌注损伤大鼠的凝血功能［3］，但具体机制未明。组织因子（TF）、单核细胞蛋白酶激活受体-1（PAR-1）、TNF-α表达上调加剧了炎症级联与凝血反应的恶性循环［4-5］。本文在大鼠肠缺血-再灌注损伤模型上，观察大鼠凝血功能和血中TF、PAR-1、PAR-3、TNF-α含量的变化及H2S的影响。

1　材料和方法

1.1材料

1.1.1实验动物：清洁级雄性Wistar大鼠24只，6周龄，体质量200～250 g，由浙江大学医学院动物中心提供（动物合格证号：201001018），动物实验方案经温州医科大学附属义乌医院动物伦理委员会审核并同意实施。

1.1.2主要试剂：敏感硫电极和PXS-270离子（上海雷磁仪器厂），组织型纤溶酶原激活物（t-PA）、纤溶酶原激活物抑制剂-1（PAI-1）、TF、TNF-α ELISA试剂盒、异硫氰酸荧光素（FITC）标记抗鼠PAR-1、PAR-3抗体试剂盒（美国Santa Cruz司），Trizol（美国Promega公司）。

1.2方法

1.2.1动物分组与处理方法：将大鼠随机分为A（假手术）组、B（缺血-再灌注）组，C（缺血-再灌注+NaHS）组，每组8只。剖腹及游离肠系膜上动脉（SMA），无损伤动脉夹钳夹B、C组大鼠SMA 60 min和再灌注120 min，建立大鼠肠缺血-再灌注损伤模型［1-2］。在再灌注前10 min C组大鼠经尾静脉注入100 μmol/kg NaHS并以1 mg/（kg·h）速度静脉维持到再灌注2 h。A、B组大鼠经尾静脉注入相同体积的0.9%氯化钠溶液，作用时间和持续时间均同C组［1-2］。实验结束后处死大鼠，取血离心分离血浆。

1.2.2血浆H2S浓度测定：参照文献［6-7］，敏感硫电极法测定血浆H2S浓度。

1.2.3血浆抗凝血酶活性（AT∶A）、纤溶酶原活性（PLG∶A）、检测凝血VIII因子活性（FVIII∶C）、血管性血友病因子（vWF）、血小板测定：参照文献［8-9］，Sysmex CA-1500自动血凝仪检测血浆AT∶A、PLG∶A、FVIII∶C、vWF含量，血细胞分析仪测定血小板。

1.2.4PAR-1、PAR-3表达：参照文献［4-5］，采集外周血单核细胞，于细胞悬液中加入1 μg/106细胞FITC标记抗鼠PAR-1、PAR-3抗体，4 ℃避光孵育15 min，加入2 mL PBS洗涤1次，加入0.4 mL PBS，流式细胞仪检测其平均荧光强度。

1.2.5血浆TF、TNF-α、t-PA、PAI-1测定：严格按试剂盒说明，ELISA法检测血浆TF、TNF-α、t-PA、PAI-1浓度。

1.2.6RT-PCR检测大鼠单核细胞PAR-1、PAR-3 mRNA的表达：大鼠PAR-1引物序列为5’-CAGCTCCTGG CTGACACTCTTGTCGGC-3’（上游），5’-CGAGCAGGGTTTC ATTGAGCACAT-3’（下游），扩增片段为500 bP；PAR-3引物序列为5’-GGCTGGACAGGAGCCACGAT-3’（上游），5’-A GCGGTTGATGCTGATGCAGG-3’（下游），扩增片段为403 bP；内参β-actin引物序列为5’-AGGGGCCGG ACTCGTCATACT-3’（上游），5’-GGCGGCAACACCATGTACC CT-3’（下游），扩增片段为202 bp。采集外周血单核细胞，一步法提取血单核细胞总RNA，电泳见28、18 s条带，以5 μg总RNA为模板，以Random Premier为引物进行反转录反应合成cDNA。PCR的反应条件为：95 ℃预变性3 min后，95 ℃变性30 s、（PAR-1）61 ℃/（PAR-3）58 ℃/（β-actin）55 ℃退火30 s、72 ℃延伸50 s共35个循环，72 ℃延伸7 min。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，采用UVPGD800图像分析处理系统进行分析，以PAR-1、PAR-3/β-actin值表示PAR-1、PAR-3 mRNA含量。

1.3统计学处理方法 采用SPSS13.0统计软件进行分析。计量资料用±s表示，多样本均数比较采用单因素方差分析，多样本均数间两两比较用Q检验，相关性采用直线相关分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1各组大鼠血FVIII：C、vWF、PLG：A、AT：A和血小板计数比较 C组FVIII∶C、vWF均显著低于B组、高于A组，PLG∶A、AT∶A低于A组、高于B组（均P＜0.01），各组大鼠血小板计数比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1　各组大鼠FVIII∶C、vWF、PLG∶A、AT∶A、t-PA、PAI-1和血小板检测（n=8，±s）

表1　各组大鼠FVIII∶C、vWF、PLG∶A、AT∶A、t-PA、PAI-1和血小板检测（n=8，±s）

与A组比：aP＜0.01；与B组比：bP＜0.01

组别　FVIII∶C（%）　vWF（%）　PLG∶A（%）　AT∶A（%）　　血小板（×109/L）　t-PA（μg/L）　PAI-1（ng/L）A　 89.2±12.4ab　76.4± 8.2ab　78.4±8.7ab　87.1±9.5ab　18.4±3.2　 4.5±0.5ab　427.4±24.3abB　150.6±22.6ab　142.5±12.5ab　50.7±6.2ab　67.2±7.2ab　16.6±2.4　12.7±1.2ab　854.2±41.7abC　120.5±19.8ab　112.6± 9.7ab　61.3±5.4ab　74.6±6.7ab　17.2±1.8　 6.4±0.8ab　642.7±32.1ab

2.2各组大鼠血t-PA、PAI-1的变化 C组t-PA、PAI-1均显著低于B组、高于A组（均P＜0.01），B组t-PA/PAI-1值显著高于A和C组（P＜0.01），见表1。

2.3各组大鼠PAR-1、PAR-3、TF、TNF-α、H2S表达

C组PAR-1、PAR-1 mRNA、TF、TNF-α均显著低于B组、高于A组，H2S低于A组、高于B组（均P＜0.01）；3组PAR-3表达差异无统计学意义（P＞0.05），见表2、图1。

表2　各组大鼠H2S、PAR-1、PAR-3、TF、TNF-α检测（n=8，±s）

表2　各组大鼠H2S、PAR-1、PAR-3、TF、TNF-α检测（n=8，±s）

与A组比：aP＜0.01；与B组比：bP＜0.01

组别　H2S（μmol/L）　PAR-1（ng/L）　PAR-1 mRNA　 PAR-3（ng/L）　PAR-3 mRNA　 TF（ng/L）　TNF-α（ng/L）A　42.57±7.18ab　12.27±3.12ab　0.22±0.03ab　18.63±4.32　 0.27±0.02　 98.5±12.4ab　4.08±0.94abB　24.38±2.69ab　56.12±9.07ab　0.68±0.06ab　19.27±5.14　 0.26±0.03　 542.6±29.4ab　49.02±1.62abC　35.27±3.14ab　32.16±8.43ab　0.34±0.04ab　17.46±3.69　 0.28±0.04　 345.7±32.1ab　39.27±1.54ab

图1　各组大鼠血单核细胞PAR-1、PAR-3 mRNA表达

2.4各指标的相关性 H2S与PAR-1、PAR-1 mRNA、TF、TNF-α、FVIII∶C、vWF、t-PA、PAI-1呈负相关（r= -0.58、-0.68、-0.62、-0.64、-0.73、-0.55、-0.57、-0.64，均P＜0.01），与PLG∶A、AT∶A呈正相关（r=0.57、0.61，均P＜0.01）。FVIII∶C、vWF、t-PA、PAI-1与PAR-1呈正相关（r=0.56、0.62、0.67、0.54，均P＜0.01），与PAR-1 mRNA呈正相关（r=0.53、0.57、0.56、0.64，均P＜0.01），与TF呈正相关（r=0.72、0.59、0.72、0.75，均P＜0.01），与TNF-α呈正相关（r=0.63、0.71、0.73、0.67，均P＜0.01）。PLG∶A、AT∶A与PAR-1呈负相关（r=-0.77、-0.69，均P＜0.01），与TF呈负相关（r=-0.61、-0.64，均P＜0.01），与TNF-α呈负相关（r=-0.55、-0.74，均P＜0.01）。

3　讨论

缺血-再灌注损伤大鼠氧自由基、炎症递质、细胞因子［1-2］、内毒素等大量释放引起血管内皮细胞功能损害。血管内皮损伤暴露的胶原纤维，与胶原受体糖蛋白、整合素或与胶原连接的vWF和整合素结合并黏附血小板［8-10］。血管内皮细胞和血小板α颗粒合成的糖蛋白vWF，保护FVIII的活性，促进血小板黏附于内皮细胞，形成稳定的不可逆转的血栓；vWF和FVIII的增加反映了机体同时存在血管内皮细胞损伤和凝血系统的激活［8-10］。抗凝血酶（AT）是主要的生理性抗凝物质［8-9］。当机体凝血功能亢进、局部发生凝血时，与纤维蛋白结合的单链糖蛋白PLG，被组织纤溶酶原激活剂或单链尿激酶活化为纤溶酶，启动纤溶系统［11-12］。t-PA/PAI-1是衡量纤溶功能的指标［11-12］。本研究结果显示，B组FVIII∶C、vWF、t-PA、PAI-1、t-PA/PAI-1显著高于A组，PLG∶A、AT∶A低于A组，表明大鼠肠缺血-再灌注损伤时血管内皮细胞损伤和凝血、纤溶系统激活，表现为凝血功能异常。

PAR-1、PAR-3是G蛋白偶联受体家族中的重要成员，由凝血酶激活。PAR-1、PAR-3可激活血小板，促进血小板聚集，参与凝血过程，参与细胞因子、递质的释放；增加血管的渗出以及中性粒细胞的趋化，参与血管扩张、血管收缩、细胞增生等炎症及变态反应的病理过程［13］。本研究发现：大鼠单核细胞可表达PAR-1、PAR-3，与Adams等［13］研究结果相一致。缺血-再灌注损伤大鼠小肠黏膜通透性增加，肠源性细菌移位［1-2］。机体在感染致病因子的刺激下，TF表达上调，启动内、外凝血途径激活凝血系统；TF与FVII结合形成TF-FVIIα复合物并激活凝血酶原形成凝血酶；TF-FVIIα复合物和凝血酶又可以结合单核细胞PAR-1，引起TNF-α的合成和释放［4-5］。TNF-α激活细胞因子级联反应［14］，诱导TF表达，加剧炎症级联与凝血反应的恶性循环［4-5］。本研究结果显示B组TF、PAR-1、PAR-1 mRNA、TNF-α显著高于A组，与PLG∶A、AT∶A负相关，与FVIII∶C、vWF、t-PA、PAI-1正相关，提示肠缺血-再灌注损伤大鼠PAR-1、TF、TNF-α表达上调，介导凝血功能异常。

H2S由小肠组织CSE催化L-半胱氨酸生成，对肠缺血-再灌注损伤大鼠小肠黏膜屏障、肝脏功能障碍起保护作用［1-2］；可改善肠缺血-再灌注损伤大鼠的凝血功能［3］。本研究结果显示，A组血H2S显著高于B组，表明内源性H2S对维持凝血功能正常发挥重要作用。本研究发现C组FVIII∶C、vWF、t-PA、PAI-1、t-PA/PAI-1显著低于B组，PLG∶A、AT∶A、H2S显著高于B组，提示予以外源性H2S供体（NaHS）后，血H2S浓度升高，改善大鼠肠缺血-再灌注损伤时的凝血功能异常。

本研究还发现：C组PAR-1、PAR-1 mRNA、TF、TNF-α显著低于B组，而PAR-3基因表达量差异无统计学意义，提示H2S下调肠缺血-再灌注损伤大鼠PAR-1、TF、TNF-α表达。相关分析研究显示，H2S与PAR-1、PAR-1 mRNA、TF、TNF-α、FVIII∶C、vWF、t-PA、PAI-1负相关，与PLG∶A、AT∶A正相关，H2S通过降低PAR-1、TF、TNF-α含量，进而改善大鼠肠缺血-再灌注损伤时的凝血功能异常。NaHS能否作为一种药物用于治疗大鼠肠缺血-再灌注损伤时的凝血功能异常，待进一步研究。

参考文献：

［1］闫兴军，卢根林，邓勇. 硫化氢在肠缺血-再灌注损伤大鼠肠黏膜屏障功能障碍中的作用［J］. 中华实验外科杂志，2010，27（1）： 71-74.

［2］卢根林，闫兴军，邓勇，等. 硫化氢在肠缺血-再灌注损伤大鼠肝脏功能障碍中的作用［J］. 中华实验外科杂志，2010，27（7）： 907-910.

［3］斯伟宏，卢根林，黄惊鸿，等. 血硫化氢与肠缺血-再灌注损伤大鼠凝血功能相关性研究［J］. 浙江中西医结合杂志，2014，4（1）： 16-17.

［4］归咏刚，姚咏明，柴艳芬. 血必净注射液对脓毒症大鼠单核细胞组织因子及凝血功能的影响［J］. 中华实验外科杂志，2010，27（1）： 32-34.

［5］归咏刚，姚咏明，柴艳芬. 血必净注射液对内毒素刺激大鼠单核细胞组织因子的影响［J］. 中华实验外科杂志，2009，26（3）： 289-291.

［6］斯伟宏. 硫化氢在急性腹膜炎患者血浆中的表达及意义［J］. 温州医学院学报，2012，42（2）： 181-182.

［7］耿彬，杜军保，唐朝枢. 敏感硫电极法在测定心血管组织细胞及血浆胱硫醚-γ-裂解酶/硫化氢的应用［J］. 北京大学学报（医学版），2005，37（5）： 545-548.

［8］施红旗，王明山，张启瑜，等. 胃癌患者凝血功能变化的研究［J］. 温州医学院学报，2004，34（4）： 182-184.

［9］计光，李玲文，王霄霞，等. 经静脉永久心脏起搏器植入前后凝血功能的变化及临床意［J］. 温州医学院学报，2007，37（3）： 212-214.

［10］谢耀盛，王明山，金艳慧，等. 子宫肌瘤患者雌激素水平对凝血纤溶功能的影响及其临床意义［J］. 温州医科大学学报，2014，44（5）： 360-362.

［11］杨丽红，郝秀萍，丁红香，等. 两个γTrp208Leu杂合突变导致的遗传性低纤维蛋白原血症家系表型和基因型分析［J］.温州医科大学学报，2015，45（7）： 525-529.

［12］陶晓晓，王鹏，金云龙，等. 不同剂量乌拉地尔对急性缺血性卒中血压和院内时间延误的影响［J］. 温州医科大学学报，2015，45（9）： 671-673.

［13］ADAMS M N，RAMACHANDRAN R，YAU M K，et al. Structure，function and pathophysiology of protease activated receptors［J］. Pharmacol Ther，2011，130（3）: 248-282.

［14］代佳，吕建祎，张敏，等. 人支气管上皮细胞中苯并芘诱导TNF-α表达的分子机制［J］. 温州医科大学学报，2014，44 （5）： 781-786.

（本文编辑：赵翠翠，丁敏娇）

Effects of hydrogen sulfide on coagulation dysfunction in rats with intestinal ischemia-reperfusion injury

LU Genlin1，WU Aibing2，WANG Hongbin3. 1.The First Department of General Surgery，Yiwu Central Hospital，Jinhua，322000； 2.Oncology Center，the Affiliated Hospital of Guangdong Medical College，Zhanjiang，523808； 3.Department of Hepatopancreatobiliary Surgery，the Affiliated Hospital of Qinghai University，Xining，810001

Abstract:Objective: To study the effects of hydrogen sulfide on coagulation dysfunction in rats with intestinal ischemia-reperfusion injury and its mechanism. Methods: Twenty-four male Wistar rats were randomly divided into three groups （8 in each group）: sham operation group （group A），ischemia-reperfusion group （group B），ischemia-reperfusion and sodium hydrosulfide group （group C）. The animal model of intestinal ischemia-reperfusion was established. Rats in Group C were received sodium hydrosulfide （100 μmol/kg bolus+1 mg·kg-1· h-1infusion） 10 min prior to the onset of reperfusion. Expressions of PAR-1 and PAR-3 were detected by RT-PCR and flow cytometry. Serum H2S was tested by sensitive sulfide electrode. Serum TF，TNF-α，t-PA，PAI-1 were determined by ELISA. PLG:A，FVIII:C，vWF，AT:A，platelet were measured. Results: PAR-1，PAR-1 mRNA，TF，TNF-α，FVIII:C，vWF，t-PA，PAI-1 in group C were significantly higher than those in group A，predominantly lower than those in group B （P＜0.01）. H2S，PLG:A，AT:A in group C were sharply higher than those in group B，strikingly lower than those in group A （P＜0.01）. H2S negatively correlated with PAR-1，PAR-1 mRNA，TF，TNF-α，FVIII:C，vWF，t-PA，PAI-1 （r=-0.58，-0.68，-0.62，-0.64，-0.73，-0.55，-0.57，-0.64，P＜0.01），positively correlating with PLG:A，AT:A （r=0.57，0.61，P＜0.01）. Conclusion: H2S attenuates coagulation dysfunction in rats with intestinal ischemia-reperfusion injury by down-regulating PAR-1，TF，TNF-α.

Key words:intestinal ischemia-reperfusion injury； hydrogen sulfide； coagulation function； rats

作者简介：卢根林（1973-），男，浙江龙游人，副主任医师，硕士。

基金项目：国家自然科学基金青年科学基金资助项目（812016 72）；义乌市人才引进立项项目（2012-R-04）。

收稿日期：2015-09-14

［中图分类号］R656.7

［文献标志码］A

DOI:10.3969/j.issn.2095-9400.2016.05.007