β-Conglycinin对不同发育时期鲤鱼消化酶活力的影响

邢秀苹，赖红娥，赵　晗，杨欢欢，吴莉芳，闫　磊

(1 吉林农业大学 动物科技学院，吉林 长春 130118；2 厦门利洋水产科技有限公司，福建 厦门 361012)



β-Conglycinin对不同发育时期鲤鱼消化酶活力的影响

邢秀苹1，赖红娥1，赵晗1，杨欢欢2，吴莉芳1，闫磊1

(1 吉林农业大学 动物科技学院，吉林 长春 130118；2 厦门利洋水产科技有限公司，福建 厦门 361012)

[摘要]【目的】 研究β-伴大豆球蛋白(β-Conglycinin)对鲤幼鱼、稚鱼蛋白酶和淀粉酶活力的影响。【方法】 以初始体质量为(10.06±0.14) g/尾的鲤稚鱼和(110.23±0.23) g/尾的鲤幼鱼为研究对象，以鱼粉为动物蛋白源，面粉、糊精为糖源，混合油脂(m(鱼油)∶m(玉米油)=1∶1)为脂肪源，分别配制5种等氮(鲤幼鱼和稚鱼粗蛋白质量分数分别为36%和40%)、等能(鲤幼鱼和稚鱼总能分别是15.2和16.9 MJ/kg) 的半精制饲料，其β-Conglycinin的添加量(质量分数)分别为0(CK)，2.0%，4.0%，6.0%和8.0%，每组饲料设3个重复，在控温单循环养殖系统中进行为期8周的饲养试验，试验结束后，取鲤幼鱼、稚鱼的前、中、后肠道和肝胰脏，分别用福林-酚试剂法和淀粉酶试剂盒法，测定肠道和肝胰脏蛋白酶及淀粉酶的活力。【结果】 鲤幼鱼肝胰脏蛋白酶活力各组之间差异不显著(P>0.05)；β-Conglycinin 添加量为6.0%和8.0%组的前肠、中肠蛋白酶活力显著低于对照组(P<0.05)；而β-Conglycinin添加量为8.0%组后肠蛋白酶活力显著低于对照组(P<0.05)。在鲤稚鱼肝胰脏和后肠，β-Conglycinin添加量为8.0%组的蛋白酶活力显著低于对照组(P<0.05)；前肠蛋白酶活力则以2.0%，4.0%，6.0%和8.0%添加组显著低于对照组(P<0.05)；中肠蛋白酶活力为4.0%，6.0%和8.0%添加组显著低于对照组(P<0.05)。 β-Conglycinin对鲤幼鱼和稚鱼肝胰脏、前肠、中肠及后肠淀粉酶活力均无显著影响(P>0.05)。【结论】 鲤幼鱼配合饲料中β-Conglycinin的添加量不应超过6.0%；鲤稚鱼配合饲料中β-Conglycinin的添加量不应超过2.0%。

[关键词]β-伴大豆球蛋白；鲤；幼鱼；稚鱼；蛋白酶；淀粉酶

随着集约化水产养殖的发展，鱼粉资源短缺，寻求鱼粉蛋白源替代品已成为国际性研究课题。大豆蛋白源是水产饲料应用最多的植物蛋白源之一。目前，国内外学者在大豆蛋白源替代鱼粉方面做了许多研究，涉及的鱼类主要有虹鳟(Oncorhynchusmykiss)[1]、金头鳟(SparusaurataL.)[2]、大西洋鲑(SalmosalarL.)[3]、杂交罗非鱼(Oreochromisniloticus×O.aureus)[4]、草鱼(Ctenopharyngondonidellus)[5]、大黄鱼(PseudoscjaenacroceaR.)[6]、异育银鲫 (Carassiusauratusgibelio)[7]、齐口裂腹鱼(Schizothoraxprenanti)[8]、埃及胡子鲇(Clariaslazera)[9]、鲤鱼(Cyprinuscarpio)[10]等，研究的内容多集中在大豆蛋白源替代鱼粉蛋白后对鱼类摄食、消化、生长、健康等的影响。这些研究表明，以过量的大豆蛋白替代鱼粉蛋白，不仅会影响鱼类肠上皮细胞增生及肠道组织形态，而且会影响鱼类对饲料的消化及生长性能。其主要原因是大豆蛋白中含有多种抗营养因子，其中大豆抗原蛋白是大豆中主要的抗营养因子之一。β-伴大豆球蛋白(β-Conglycinin)比大豆球蛋白(Glycinin)具有更强的抗原性[11]，普通的热处理不能灭活β-伴大豆球蛋白的免疫活性，其能够引起鱼类消化道过敏，造成胃、肠道损伤，进而引起消化吸收障碍，甚至死亡。但由于大豆抗原蛋白具有蛋白含量高、价格低廉、来源丰富等优点，因此国内外学者就大豆抗原蛋白对动物的影响进行了广泛研究。目前，关于大豆抗原蛋白的研究主要集中在猪[12]、犊牛[13]、鼠[14]、羔羊[15]等陆生动物上，而对水产动物研究报道较少，仅见郭林英[16]研究了大豆β-伴球蛋白提取物对鲤鱼肠上皮细胞增殖及其功能的影响。鱼类消化道的消化酶是影响饲料消化吸收的主要因素，消化酶受体内外多种因素的影响。本研究分别以鲤幼鱼和稚鱼为供试动物，研究了β-Conglycinin对不同发育时期鲤鱼消化酶活力的影响，旨在为合理开发利用大豆蛋白源及大豆抗原蛋白的去除提供依据。

1材料与方法

1.1β-Conglycinin的分离纯化

β-Conglycinin采用简化膜中间试验方法[17]获得。

1.2试验饲料

以鱼粉为动物蛋白源，面粉、糊精为糖源，混合油脂(m(鱼油)∶m(玉米油)=1∶1)为脂肪源，分别配制5种等氮(鲤幼鱼和稚鱼的蛋白质量分数分别为36%和40%)、等能(鲤幼鱼和稚鱼总能分别为15.2和16.9 MJ/kg) 的半精制饲料，β-Conglycinin的添加量(质量分数)分别为0(对照，CK)，2.0%，4.0%，6.0%和8.0%。各原料粉碎后过孔径0.246 mm的筛，按配方准确称其质量，在吉林农业大学动物水产实验室用电动绞肉机制成粒径1.5 和2.5 mm颗粒饲料。晒干后置于-20 ℃冰箱中保存备用。鲤幼鱼和稚鱼的试验饲料组成及营养成分见表1和表2。

表 1　鲤幼鱼饲料配方及营养水平(风干基础)

表 2　鲤稚鱼饲料配方及营养水平(风干基础)

1.3饲养条件及管理

养殖试验在吉林农业大学控温单循环系统中进行，试验期间连续充气，水中氨氮质量浓度低于0.5 mg/L，溶解氧高于5.0 mg/L，温度为25～27 ℃，养殖试验持续8周。

试验鱼来源于吉林省九台市渔场，试验前饱食投喂对照组饲料，预饲15 d，预饲试验结束后，饥饿24 h，挑选鳍鳞完整、规格整齐、体质健壮的鲤幼鱼((110.23±0.23) g/尾) 300尾和鲤稚鱼((10.06±0.14) g/尾) 450尾，分别随机放养在15个玻璃缸中，鲤幼鱼每缸放养20尾，鲤稚鱼每缸放养30尾。放养前用质量浓度为20 mg/L的高锰酸钾溶液药浴10 min，随机安排3个玻璃缸为一个试验组。在试验过程中，每天称取足量饲料，分2次投喂(09:00，16:00)，投饵方式为人工手撒，直至鱼不再到水面摄食为止，日投饵率为体质量的3%～5%，每天记录每缸鱼的摄食饲料质量。

1.4样品的收集与粗酶液的制备

参照吴莉芳等[18]的方法进行样品收集与粗酶液制备。(1)样品的收集。饲养试验结束前停食24 h后，每缸活体解剖10尾鱼，取出肝胰脏和其他内脏，称其质量(精确到0.01 g)。取出肠道和肝胰脏，剔除附着物，用去离子水冲洗肠道内容物，滤纸吸干，-20 ℃冰柜保存待测。肠道从第一个回折点以前为前肠，最后一个回折点以后为后肠，其间为中肠。(2)粗酶液的制备。称样品质量，加入10倍体积的高纯水匀浆，在4 ℃冰箱中静置过夜，5 000 r/min离心10 min，取上清液即为粗酶液，4 ℃冰箱保存、待测。粗酶液需在24 h内测定完毕。

1.5消化酶活力的测定

蛋白酶活力采用福林-酚试剂法(Folin-phenol)测定[18]；淀粉酶活力采用淀粉酶试剂盒(南京建成科技有限公司)测定[18]。

1.6数据统计分析

采用SPSS17.5软件对鲤幼鱼、稚鱼蛋白酶及淀粉酶活力进行方差分析，若差异显著，进一步进行LSD和Duncan’s多重比较，分析组间差异显著性。试验数据用“平均值±标准差”(Mean±SD)表示。显著性水平设定为P<0.05。

2结果与分析

2.1β-Conglycinin对鲤幼鱼和稚鱼蛋白酶活力的影响

β-Conglycinin对鲤幼鱼、稚鱼蛋白酶活力的影响分别见表3和表4。

表 3　β-Conglycinin对鲤幼鱼蛋白酶活力的影响

注：同列数据后标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下表同。

Note：Different lowercase letters in each column indicate significant difference(P<0.05).The same below.

表 4　β-Conglycinin对鲤稚鱼蛋白酶活力的影响

由表3可以看出，鲤幼鱼肝胰脏蛋白酶活力各组之间差异不显著(P>0.05)。2.0%和4.0% β-Conglycinin 添加组前肠、中肠蛋白酶活力与对照组差异不显著(P>0.05)，6.0%和8.0% β-Conglycinin添加组前肠、中肠蛋白酶活力显著低于对照组(P<0.05)；8.0% β-Conglycinin添加组前肠蛋白酶活力显著低于2.0%，4.0%和6.0%添加组(P<0.05)，6.0% β-Conglycinin添加组前肠蛋白酶活力显著低于2.0%和4.0%添加组(P<0.05)；6.0%和8.0%β-Conglycinin添加组中肠蛋白酶活力显著低于2.0%及4.0%添加组(P<0.05)。2.0%，4.0%，6.0%β-Conglycinin添加组后肠蛋白酶活力与对照组差异不显著(P>0.05)，8.0%添加组后肠蛋白酶活力显著低于对照组(P<0.05)；2.0%，4.0%，6.0%和8.0%添加组之间后肠蛋白酶活力无显著差异(P>0.05)。

由表4可知，在鲤稚鱼肝胰脏和后肠中，2.0%， 4.0%和6.0% β-Conglycinin添加组蛋白酶活力与对照组差异不显著(P>0.05)，8.0%β-Conglycinin添加组蛋白酶活力显著低于对照组(P<0.05)，2.0%，4.0%，6.0%和8.0%β-Conglycinin添加组之间蛋白酶活力无显著差异(P>0.05)；在鲤稚鱼前肠中，2.0%， 4.0%，6.0%和8.0% β-Conglycinin添加组蛋白酶活力显著低于对照组(P<0.05)，2.0%和4.0% β-Conglycinin添加组蛋白酶活力显著高于6.0%及8.0%添加组(P<0.05)；在鲤稚鱼中肠中，2.0% β-Conglycinin添加组蛋白酶活力与对照组差异不显著(P>0.05) ， 而4.0%，6.0%和8.0%β-Conglycinin添加组蛋白酶活力显著低于对照组(P<0.05)，2.0%β-Conglycinin添加组蛋白酶活力显著高于4.0%，6.0%和8.0%添加组(P<0.05)，4.0%β-Conglycinin添加组蛋白酶活力显著高于6.0%和8.0%添加组(P<0.05)。

2.2β-Conglycinin对鲤幼鱼和稚鱼淀粉酶活力的影响

表5和表6表明，在本试验条件下，2.0%， 4.0%，6.0%和8.0%β-Conglycinin添加组鲤幼鱼与稚鱼肝胰脏、前肠、中肠、后肠淀粉酶活力与对照组差异均不显著(P>0.05)。

表 5　 β-Conglycinin对鲤幼鱼淀粉酶活力的影响

表 6　β-Conglycinin对鲤稚鱼淀粉酶活力的影响

3讨论

3.1β-Conglycinin对鲤幼鱼和稚鱼蛋白酶活力的影响

本研究结果表明，β-Conglycinin对鲤幼鱼和稚鱼的前肠、中肠、后肠蛋白酶活力的影响存在一定的差异。在鲤幼鱼的配合饲料中，β-Conglycinin添加量为6.0%和8.0%组前肠、中肠蛋白酶活力显著低于对照组(P<0.05)；在鲤稚鱼的配合饲料中，β-Conglycinin 添加量为2.0%，4.0%，6.0%和 8.0% 组前肠蛋白酶活力显著低于对照组(P<0.05)，而中肠蛋白酶活力则以4.0%，6.0%和8.0% β-Conglycinin添加组显著低于对照组(P<0.05)。这可能是由于鲤幼鱼和稚鱼消化道结构发育程度不同，对β-Conglycinin的敏感性不同所致。鲤稚鱼消化系统发育尚不成熟，消化器官不发达，消化机能不完善，消化道中酶的分泌量不足，使大量未消化的营养物质进入了肠道。因此，β-Conglycinin也可大量进入肠道，引起肠道损伤，从而导致消化酶活力降低。张帆等[6]研究了饲料中豆粕替代鱼粉对大黄鱼消化酶活性的影响，结果表明，大黄鱼肠道胰蛋白酶的活性随豆粕替代水平的升高而显著降低。Burrells等[19]研究表明，在饲料中添加一定量的大豆蛋白，会引起虹鳟的后肠结构形态变化，并降低刷状缘的酶活性。Krogdahl等[20]研究发现，豆粕能够引起虹鳟中肠与后肠上皮刷状缘胞外酶碱性磷酸酶、亮氨酸氨肽酶以及麦芽糖酶、乳糖酶、蔗糖酶活性下降。吴莉芳等[9]研究了去皮豆粕替代鱼粉对埃及胡子鲇消化酶活力的影响，结果表明，当去皮豆粕替代鱼粉蛋白的45%和60%时，埃及胡子鲇前肠和后肠的蛋白酶活力显著下降。Ksudhik 等[21]在大西洋鲑的饲料中添加一定量的大豆蛋白，引起其后肠结构发生形态变化，刷状缘的酶活性降低。关于不同添加量的β-Conglycinin引起不同发育时期鲤鱼肠道组织结构的变化，需进一步通过组织学方法进行研究。

3.2β-Conglycinin对鲤幼鱼和稚鱼淀粉酶活力的影响

鱼类的淀粉酶是碳水化合物水解酶类的一种，活性较低，同种鱼类不同消化器官淀粉酶的活力不同，另外随着鱼类年龄的增加，其淀粉酶活力也发生改变，淀粉酶活性在同一消化器官不同部位也会有所差异。彭翔等[22]在黑鲷鱼饲料中用发酵豆粕替代0～50%的鱼粉蛋白质，研究结果表明，饲料中各组淀粉酶的活性差异不显著。吴莉芳等[23]研究了不同大豆蛋白源替代鱼粉对鲤鱼蛋白酶和淀粉酶活力的影响，结果表明，不同大豆蛋白源对鲤鱼淀粉酶活力影响不显著。钱曦等[24]研究报道，在翘嘴红鲌的饲料中，当豆粕替代鱼粉蛋白的13%和27%时，对其肝胰脏和肠道淀粉酶活力影响不显著。在本试验条件下，β-Conglycinin 的添加量对鲤幼鱼和稚鱼肝胰脏、前肠、中肠、后肠淀粉酶活力影响均不显著。这主要是由于鱼类的淀粉酶对食物类型和饲料组成有明显的适应性[25]。鲤鱼属于杂食性鱼类，在天然的食谱中存在一定量的植物蛋白源，而β-Conglycinin就属于植物蛋白源。因此，鲤鱼肝胰脏和肠道淀粉酶对β-Conglycinin具有一定的适应性。

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Effects of β-Conglycinin on activities of protease and amylase in juvenile and larval common carps

XING Xiu-ping1,LAI Hong-e1,ZHAO Han1,YANG Huan-huan2,WU Li-fang1,YAN Lei1

(1FacultyofAnimalScienceandTechnology,JilinAgriculturalUniversity,Changchun,Jilin130118,China;2LiyangXiamenAquaticTechnologyCompanyLimited,Xiamen,Fujian361012,China)

Abstract：【Objective】 The research investigated the effects of β-Conglycinin on activities of protease and amylase in juvenile and larval common carps.【Method】 Larval and juvenile common carps with the initial weights of (10.06±0.14) g/tail and (110.23±0.23) g/tail were used as experimental objects for eight-week feeding trial at controlled temperature in single recirculating system.Five diets with identical nitrogen (total crude protein contents for juvenile and larval were 36% and 40%,respectively) and energy (total energies for juvenile and larval were 15.2 and 16.9 MJ/kg,respectively) as well as different β-Conglycinin contents (0(CK),2.0%,4.0%,6.0%,and 8.0%) were provided.Fish meal was animal protein source,dextrin and flour were carbohydrate source,and mixed oil (m(corn oil)∶m(fish oil)=1∶1) was fat source.Each group had three repetitions.The activities of protease and amylase in foregut,midgut and hepatopancreas were detected using Folin-phenol method and Amylase kit.【Result】 No significant effects of β-Conglycinin on activities of protease in hepatopancreas of juvenile common carps were observed (P>0.05).The activities of protease in foregut and midgut of juvenile common carps in 6.0% and 8.0% groups were significantly lower than that of the control group (P<0.05),and that in hindgut of 8.0% group were significantly lower than that of the control group (P<0.05).The activities of protease in hepatopancreas and hindgut of larval common carps in 8.0% groups were significantly lower than that of the control group (P<0.05),that of 2.0%,4.0%,6.0%,and 8.0% groups were significantly lower (P<0.05) in foregut,and that of 4.0%,6.0%,and 8.0% groups were significantly lower (P<0.05) in midgut.In addition,no significant effects of β-Conglycinin on activities of amylase in hepatopancreas and tract of both juvenile and larval common carps were observed (P>0.05).【Conclusion】 The amount of β-Conglycinin should be less than 6.0% and 2.0% in the diet of juvenile and larval common carp,respectively.

Key words：β-Conglycinin;Cyprinus carpio;juvenile common carp;larval common carp;protease;amylase

[文章编号]1671-9387(2016)01-0019-06

[中图分类号]S965.116.31+2

[文献标志码]A

[作者简介]邢秀苹(1989-)，女，吉林农安人，在读硕士，主要从事水产动物营养与饲料研究。E-mail:461934406@qq.com[通信作者]吴莉芳(1970-)，女，吉林农安人，教授，博士，主要从事水产动物营养与饲料研究。

[基金项目]吉林省教育厅项目(2012043)

[收稿日期]2014-04-10

DOI：网络出版时间:2015-12-0214:2510.13207/j.cnki.jnwafu.2016.01.004

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20151202.1425.008.html