肝癌大鼠体内TH17/Treg失衡及意义

2016-06-03黄刚哲

中国老年学杂志 2016年8期

关键词：肝癌

黄刚哲　姜　华

(延边大学附属医院老年病科，吉林　延吉　133000)

肝癌大鼠体内TH17/Treg失衡及意义

黄刚哲姜华1

(延边大学附属医院老年病科，吉林延吉133000)

〔摘要〕目的观察肝癌大鼠体内TH17/Treg失衡状态，从而探讨免疫细胞在肝癌疾病的发病机制。方法观察大鼠肝癌模型和对照组，提取脾脏单个核细胞，流式细胞术检测CD3、CD4、CD8，TH17及Treg比例，酶联免疫吸附(ELISA)法检测血液上清白细胞介素(IL)-17及肿瘤坏死因子(TNF)-β含量变化，实时定量聚合酶链反应(PCR)检测RORγT及Foxp3含量。结果与对照组相比，肝癌组体内单个核细胞CD8表达量显著升高，CD3、CD4表达量显著降低，CD4/CD8比例显著降低(P均<0.05)；TH17细胞表达量显著升高，Treg细胞表达量显著降低(P均<0.05)；IL-17含量显著升高，TNF-β含量显著降低(P均<0.05)；RORγT含量显著升高，Foxp3含量显著降低(P均<0.05)。结论肝癌大鼠TH17/Treg失衡，具体表现为TH17细胞及相关细胞因子增多，而Treg细胞及相关细胞因子降低，提示TH17/Treg失衡与肝癌疾病具有相关性。

〔关键词〕TH17；Treg；肝癌

肝癌作为胃肠道系统常见肿瘤，与氧自由基、炎性因素、肝组织细胞坏死有密切相关，越来越多的研究表明免疫系统在肝癌发病机制中的重要作用〔1〕。TH17及Treg细胞参与多种免疫系统疾病，如多发性硬化、系统性红斑狼疮等。近年来发现，在一些肿瘤患者或是肿瘤模型体内，TH17及Treg细胞存在显著变化，提示TH17及Treg细胞参与肿瘤的发生发展〔2〕，但国内对此两种细胞是否参与肝癌致病机制仍未有定论，本研究观察大鼠肝癌模型、TH17/Treg的变化及意义。

1资料与方法

1.1一般资料40只健康雄性Balb/C大鼠，体重(20±4)g，均给予普通食料，在恒温、固定湿度及良好通风条件下饲养。大鼠随机分为2组，每组20只，对照组、不采取任何干预措施；肝癌组行大鼠肝癌模型制备。

1.2主要试剂流式抗体CD3抗体，CD4单抗和CD25单抗，IL-17A单抗，Foxp3单抗及FACS透膜剂均购于Ebioscience公司，TRIZOL裂解液、PrimeScriptTMRT reagent Kit(Perfect Real Time)及Takala SYBR® Premix Ex TaqTM Ⅱ试剂盒均购于Takala公司。

1.3肝癌大鼠模型建立大鼠适应饲养1 w后，进行模型试验的制备。取鼠源性p2肝癌细胞株注入大鼠腹腔，待腹水产生后抽取适量腹水，用腹水调整好肝癌细胞至适当浓度备用。将0.01 ml的癌细胞悬液注入肝脏中，模型制备30 d后，处死大鼠，取脾脏及血液待测。肝内注射0.01 ml的生理盐水作对照组。

1.4脾脏单个核细胞提取大鼠颈椎脱位处死，在无菌环境下取出脾脏，研磨，并经尼龙滤网过滤，收集细胞后离心洗涤，即为脾脏单个核细胞。

1.5T细胞亚群分析取脾脏单个核细胞，磷酸盐缓冲液(PBS)反复洗涤，配置成100 μl的单细胞悬液，与用异硫氰酸酯(FITC)或藻红沅素(PE)标记的流式抗体CD3、CD4、CD8混合，4℃孵育30 min，PBS洗涤2次后，每管加入300 μl的PBS重悬后，上流式细胞仪进行检测，记录结果为阳性细胞所占的比例。

1.6TH17细胞分析取脾脏单个核细胞，PBS反复洗涤，配制成100 μl的单细胞悬液，向上述悬液中加入FITC标记的抗大鼠CD4单抗10 μl，4℃避光染色30 min。经PBS洗涤一次后，应用透膜剂，并严格按照说明书步骤进行，加入别藻蓝蛋白(APC)标记的抗大鼠IL-17A单抗10 μl，混匀后室温避光孵育30 min，经PBS洗涤一次后，加入300 μl溶液，震荡混匀后，上流式细胞仪检测。

1.7Treg细胞分析取脾脏单个核细胞，PBS反复洗涤，配制成100 μl的单细胞悬液，向上述悬液中加入FITC标记的抗大鼠CD4及CD25单抗10 μl，4℃避光染色30 min。经PBS洗涤一次后，应用透膜剂，并严格按照说明书步骤进行，加入APC标记的抗大鼠Foxp3单抗10 μl，混匀后室温避光孵育30 min，经PBS洗涤一次后，加入300 μl溶液，震荡混匀后，上流式细胞仪检测。

1.8细胞因子检测取各组大鼠血清，严格按照试剂盒说明书，应用白细胞介素(IL)-17及肿瘤坏死因子(TNF)-β 酶联免疫试剂盒，检测上清细胞因子含量。

1.9mRNA 表达检测实验所需器械均经高压去RNA酶处理，并经0.1%的焦碳酸二乙酯(DEPC)水处理，且实验均在冰块上操作，降低温度对结果的影响。取脾组织，加入1 ml TRIZOL裂解5 min，一次加入三氯甲烷、异丙醇及75%乙醇进行获取RNA，10 μl DEPC水溶解RNA沉淀，紫外分光光度仪测定浓度及纯度。应用Takala逆转录试剂盒，严格按照说明书，将提取的RNA逆转录为cDNA，并应用TaKaRa SYBR® Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒，进行PCR体系的扩增及反应。其中，引物序列为：β-actin：5'-GATCATTGCTCCTCCTGAGC-3'和5'-TGTGGACTTGGGAGAGGACT-3'；Foxp3：5'-GCACAAGTGCTTTGTGCGAGT-3'和5'-TGTCTGTGGTTGCAGACGTTAT-3'；RORγT：5'-GCA GCG CTC CAA CAT CTT CT-3'和5'-ACG TAC TGA ATG GCC TCG GT-3'，试验时每个样本和基因做2个相同的复孔。

1.10统计学方法应用SPSS17.0统计软件进行t检验。

2结果

2.1两组T细胞亚群分析与对照组相比，肝癌组单个核细胞CD8表达量显著升高，CD3、CD4表达量显著降低，CD4/CD8比例显著降低(P<0.05)，见表1。

表1两组体内T细胞亚群分析(x±s,n=20)

组别CD3(%)CD4(%)CD8(%)CD4/CD8肝癌组43.2±10.31)30.9±16.11)49.3±10.51)0.9±0.71)对照组60.1±11.740.7±15.326.7±10.81.6±0.8

与对照组比较:1)P<0.05

2.2两组TH17/Treg亚群分析与对照组〔(44.2±13.6)%，(54.9±12.1)%〕相比，肝癌组CD4+IL-17+T细胞(TH17细胞)表达量〔(63.7±14.9)%〕显著升高，CD4+CD25+Foxp3+T细胞(Treg细胞)表达量〔(41.3±11.6)%〕显著降低(P<0.05)。

2.3两组细胞因子分泌水平与对照组〔(155.6±13.6)，(341.3±27.6)pg/ml〕相比，肝癌组IL-17含量〔(274.2±14.7)pg/ml〕显著升高，TNF-β含量〔(154.9±22.1)pg/ml〕显著降低(P<0.05)。

2.4两组对象转录因子表达与对照组相比，肝癌组RORγT含量(3.0±0.4 vs 1)显著升高，Foxp3含量(0.5±0.6 vs 1)显著降低(P<0.05)。

3讨论

肝癌发病率及致死率分居恶性肿瘤的第五位和第三位，多种致病因素均可诱导其发病，其确切病因至今未明，机体的免疫状态及分子免疫与肝癌的发生发展密切相关。研究表明，病毒感染多是肝癌发生的基础，造成慢性肝损伤促进肝硬化的发生，与此同时，炎症的介入则促进了肝癌进展〔3〕。多种炎症细胞和炎症因子组成的炎症微环境在肝癌进展中发挥重要作用。肿瘤相关性巨噬细胞作为一种异质性细胞，是含量最高的炎性细胞，在疾病进展中起重要作用；髓系抑制性细胞是树突细胞及巨噬细胞的前体，具有较强的免疫抑制功能；多种炎性因子，如IL-1，IL-6，IL-10也可通过多种机制来影响肝脏疾病的发生及发展〔4～6〕。

TH17及Treg细胞具有独立的分化和调节机制，且互相抑制，TH17的产生可抑制Treg的分化及发育，两者可经过多种途径影响和参与肿瘤的发生及发展。在机体正常稳态下，TH17及Treg细胞保持动态平衡，以利于机体多种免疫反应〔7〕。TH17/Treg失衡则导致炎性反应过度，参与病毒性肝炎、肝病及肝癌的发生。在慢性乙型肝炎患者外周血中，TH17细胞及分泌的相关细胞因子均增高，与此同时，Treg细胞及分泌的相关细胞因子均降低，且此种现象也出现在慢性乙型肝炎病毒携带者、静止性及活动性肝硬化疾病中，TH17及Treg细胞均可出现不同程度的变化〔8～10〕。本文提示，TH17及Treg细胞均从不同方面参与了肝癌疾病的进展中，TH17细胞具有促进肿瘤发生发展，增多的机制可能与肿瘤细胞可分泌多种TH17增殖及分化的细胞因子。而IL-17细胞的增多反过来同时抑制了Treg细胞的生成和分化〔11〕，从而导致抗肿瘤免疫的减弱。

4参考文献

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〔2014-12-15修回〕

(编辑苑云杰)