清心安神方对豚鼠心室肌细胞动作电位的影响

方居正　虞雅倩　高　颖　夏艳斐

(平顶山市中医医院内三科，河南　平顶山　467000)



清心安神方对豚鼠心室肌细胞动作电位的影响

方居正虞雅倩1高颖1夏艳斐

(平顶山市中医医院内三科，河南平顶山467000)

〔摘要〕目的探讨清心安神方对豚鼠心室肌细胞动作电位的影响。方法60只健康雄性豚鼠随机分为含药血清组24只，空白血清组36只。含药血清组使用清心安神方浓缩液连续灌胃3 d，空白血清组给予等量生理盐水进行灌胃，两组豚鼠均在末次用药1 h后，于腹主动脉取血后离心取血清。分离豚鼠心室肌细胞，用膜片钳技术记录膜电位曲线。结果含药血清组豚鼠单个心室肌细胞动作电位复极至50%(APD50)及APD90延长(P<0.05),而动作电位幅值(APA)、APD50～90及3相复极速率(V3)差异无统计学意义(P>0.05)；血清对照与血清洗脱、血清洗脱与含药血清组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论清心安神方可延长豚鼠心室肌细胞全细胞动作电位APD50及APD90。

〔关键词〕清心安神方；全细胞动作电位；动作电位时程

研究报道〔1〕，传统治疗心律失常药物的有效率为30%～60%，但几乎都伴有致心律失常的副作用，导致恶性心律失常和死亡率明显升高。清心安神方以清心除烦为治则，佐以重镇安神之品，对治疗主动性心律失常临床效果良好，但其作用机制尚未明确。本研究采用血清药理学的方法拟分析清心安神方含药血清对豚鼠心室肌细胞动作电位及内向整流钾电流的影响。

1材料与方法

1.1动物选取河南中医学院中心试验室喂养1 w，总重量250～350 g的健康成年豚鼠，常规喂养，观察其进食水、大小便及精神情况，从中选取健康雄性豚鼠60只，并随机分为含药血清组24只，空白血清组36只。

1.2血清制备含药血清组使用清心安神方制成的药液进行灌胃(剂量为豚鼠表面体积等效剂量的5倍进行换算后，以特定方法浓缩至2.25 g生药/ml)，空白血清组2次/d以相等表面体积生理盐水灌胃，连续进行3 d，末次灌胃1 h后取腹主动脉血，并将血液在室温下静置1 h，3 000 r/min离心20 min，分离上层血清，水浴灭活30 min后，存放于-20℃冰箱中备用。

1.3豚鼠心室肌细胞的分离操作在20℃～25℃的室温下，连接灌流装置，进行水浴恒温预热。无钙和含酶低钙台式液及细胞保存液均以95%O2+5%CO2持续低流量饱和30 min。灌流装置用75%酒精冲洗5 min，然后用去离子水冲灌。待恒温水浴至水浴预设值后，调节恒流蠕动泵使灌流系统出口流速为8 ml/min，然后上调水温(至39.5℃～41℃)使出口液体温度维持在37℃。关闭灌流系统，使用无钙台式液冲灌，待液柱至30 cmH2O时关闭系统。于豚鼠腹腔注射普通肝素1 000 U，10 min后以2%戊巴比妥钠30 mg/kg腹腔注射麻醉，无角膜反射后开胸暴露心脏，游离主动脉，在主动脉远心端头臂干下端摘下心脏，放入4℃无钙台式液中，打开恒流蠕动泵和灌流系统出口，把离体心脏放置在灌流系统出口上进行心脏灌流。然后使心脏停搏，用25 ml酶液单向灌流，然后再用溶解酶循环灌流心脏。待流出液拉丝明显后关闭水柱夹。在心脏底部依次取少量心室肌组织放入含有少量KB液的五个培养皿中，依次分离心室肌组织并获取单个心室肌细胞。复钙静置后选择外形比较完整、透光良好、横纹清晰无颗粒的细胞供实验使用。

1.4钳制模式在V-CLAMP下形成全细胞记录模式，分别选择I=0和I-CLAMP NORMAL模式，进行观察并描记静息电位值等指标。

1.5给药方法恒流蠕动泵灌流速度2 ml/min，台式液持续灌流5 min，记录膜电位曲线，空白血清持续灌流5 min，记录膜电位曲线，然后含药血清灌流5 min，记录膜电位曲线；最后用空白血清洗脱5 min，记录膜电位曲线。空白血清和含药血清重复交替灌流。

1.6刺激方案用1～5 nA的强度诱发动作电位，并以0.625 Hz的刺激频率刺激5 ms，实验过程中同一细胞的刺激方案应保持一致(除不能诱发AP需增强刺激强度的)。采用美国Axon公司pClampex10.1软件控制刺激信号及输入信号的采集。

1.7观察指标复极50%的动作电位时程(APD50)、APD90、动作电位幅值(APA)，APD50～90及3相复极速率(V3)。

1.8统计学方法应用SPSS19.0统计软件，组间比较进行t检验。

2结果

含药血清组豚鼠单个心室肌细胞APD50及APD90延长(P<0.05),APA、APD50～90及V3的变化不明显(P>0.05)；血清对照与血清洗脱、血清洗脱与含药血清组比较差异无统计学意义。见表1。

表1各组指标比较(n=6，x±s)

指标血清对照组含药血清组血清洗脱组APA(mV)139.2167±9.46814141.4000±19.09230137.4667±13.96233APD50(ms)446.8000±117.400311)648.4333±246.28332507.4000±140.481731)APD90(ms)483.1167±120.684671)692.0167±258.75045544.8167±144.190881)APD50～90(ms)36.3167±6.6351843.5833±17.1635037.4167±5.41273V3(V/s)-1.5533±0.276021.3900±0.316291.4850±0.18031

与含药血清组比较：1)P<0.05

3讨论

心律失常以其发病机制复杂、种类多样、表现各异、药物治疗效果欠佳为特点。目前的抗心律失常药物由于治疗效果的不确定及致心律失常作用，使其临床应用受到一定的限制。尽管目前电生理及射频消融术治疗心律失常迅速发展，但仍有一大部分治疗效果欠佳。相关研究显示〔2〕，结合中药化学成分的药理作用选药组方，化学成分复杂，可起到多靶点治疗作用。因此，可为心律失常的治疗提供新思路。清心安神方的主要成分有苦参、黄连、甘松、丹参等，其中苦参中的苦参碱能够增加左心室流出道慢反应自律细胞Na+通道的开放及Na+内流，抑制K+外流，起到抗心律失常的作用〔3〕；黄连中的黄连素可以延长心肌细胞的动作电位时程和有效不应期，影响折返环所需的时程，从而干预折返性心律失常的发生，另外其还可抑制血管平滑肌α受体，扩张冠状动脉，改善心肌缺血所致的室性心律失常〔4～7〕；胡朗吉等〔8〕报道甘松的主要成分可瞬间抑制动物心肌细胞外向钾通道；而梁玲等〔9〕通过实验证实丹参中的丹参酮ⅡA能有效缩短长QT综合征(LQT2)模型的各层心肌细胞动作电位,并且平衡各层心肌细胞动作电位复极的差异性。

本实验提示清心安神方可有效延长豚鼠心室肌细胞APD50及APD90，该方可通过延长 APD，从而改变心动周期时程，从而使不应期延长，心肌细胞间兴奋性传导减慢，从而减慢心率，降低窦房结和(或)异位起搏点的自律性，可在一定程度上改善和(或)降低心律失常的发生率。从动作电位形成机制分析，可能是由于激动心肌细胞L-型钙通道(ICa-L)电流或阻断K+通道(如IK1)电流所致。然而实验研究显示，清心安神方对豚鼠心室肌细胞APA、APD50～90及V3未产生显著影响，可能是对Na+通道及复极末期外向电流IK1或IK无作用或抑制作用较弱，从而不产生明显变化，但确切电生理机制尚不明确，还有待进一步深入研究。

4参考文献

1苏波.老年心脏介入治疗诱发迷走神经反射和严重心律失常的危险因素〔J〕.中国老年学杂志,2015;35(8):2053-5.

2刘建群,王雪梅,刘一文，等.基于影响药物代谢的中药配伍研究进展〔J〕.中国实验方剂学杂志,2014;20(19):221-4.

3刘艳明,王雪芳.氧化苦参碱对缺血缺氧致兔心律失常保护作用及机制研究〔J〕.河北医药,2015;37(9):1308-10.

4王洪建,王维新,张翠莲,等.黄连素的药理作用和临床应用进展〔J〕.社区医学杂志,2006;4(7):36-8.

5王珏玥,常红霞,费峰.盐酸黄莲素治疗心律失常56例临床观察〔J〕.黑龙江医学,1999;2(1):74.

6黄伟民,吴子达,徐有秋.黄莲素治疗心律失常的基础电生理学研究〔J〕.心电学杂志,1985;4(1):2.

7苏欣.黄连素治疗室性早搏的疗效观察〔J〕.中国保健营养(下旬刊),2013;23(6):3287.

8胡朗吉,葛郁芝,罗骏,等.甘松挥发油对大鼠心室肌细胞瞬时外向钾电流的影响〔J〕.时珍国医国药,2009;20(8):1843-5.

9梁玲,谢强,李卫华,等.丹参酮ⅡA对雌性家兔LQT2模型心肌细胞动作电位的影响〔J〕.四川大学学报(医学版)，2013;44(5):744-6.

〔2015-06-25修回〕

(编辑袁左鸣/滕欣航)

〔中图分类号〕R54

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)08-1815-02；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.08.011

基金项目：河南省2013年重点科技发展计划项目(No.132102310403)

1河南中医学院研究生学院

第一作者：方居正(1966-)，男，博士后，主任医师，主要从事中医内科心血管方面的研究。