应用胚胎干细胞模型研究环境内分泌干扰物胚胎毒性的展望

马明月

(沈阳医学院公共卫生学院，辽宁沈阳110034)



应用胚胎干细胞模型研究环境内分泌干扰物胚胎毒性的展望

马明月

(沈阳医学院公共卫生学院，辽宁沈阳110034)

[摘要]动物实验研究证明，环境内分泌干扰物具有一定的胚胎毒性，但动物实验具有一定的局限性，寻找替代动物实验的体外实验模型至关重要。目前，胚胎干细胞已成为发育毒性实验的一种崭新受试对象，能灵敏、准确地评价有害物质的毒性作用。根据胚胎干细胞特性发展起来的胚胎干细胞模型，可评价环境内分泌干扰物的潜在胚胎毒性和致畸性。

[关键词]胚胎干细胞；环境内分泌干扰物；胚胎毒性

环境内分泌干扰物(environmental endocrine disruptors，EEDs)是指环境中天然存在或污染的，可模拟生物体内激素生理、生化作用，干扰内分泌系统功能，对亲体或后代产生不良健康效应的外源化学物。邻苯二甲酸酯(phthalate esters， PAEs)作为最具代表性的EEDs[1]，每年全球范围内的使用量很大，广泛应用于儿童玩具、医疗用品、食品包装材料、化妆品中。由于在塑料制品加工过程中，PAEs并未聚合到PVC高分子的碳链上，随着时间的推移，可不断地被释放出来。PAEs难以被降解，广泛存在于土壤、水域、空气中，造成环境污染。人类尿液、血液、乳汁中均可检测到多种PAEs及其代谢产物[2-4]。近年来，许多证据显示PAEs暴露与出生缺陷、生殖异常和代谢相关性疾病密切相关[5-7]。邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯(di(2-ethylhexyl) phthalate，DEHP)是PAEs中使用最多的化学物，可通过消化道、呼吸道、皮肤等多种途径进入人体，亦可通过胎盘屏障进入胎儿体内，在胎儿体内聚集[8]。但EEDs的胚胎毒性研究还主要停留在动物实验阶段，利用胚胎干细胞(embryonic stem cell，ESC)建立发育毒物体外预测模型，可评价化学物的潜在胚胎毒性和致畸性。本文就DEHP等EEDs的胚胎毒性，ESC在胚胎发育毒性研究中的应用、优势及应用ESC模型研究EEDs胚胎毒性的意义进行综述。

1DEHP胚胎毒性研究的进展

大量动物研究证明DEHP具有胚胎毒性，影响胚胎、胎儿发育。早在1994年，Hansen等[9]应用大鼠全胚胎培养(whole embryo culture，WEC)证实DEHP原形直接作用于胚胎影响其生长和发育；Robinson等[10]通过大鼠植入后WEC，研究了DEHP的活性代谢产物邻苯二甲酸单(2-乙基)己酯(mono(2-ethylhexyl) phthalate，MEHP)对WEC的转录组基因表达变化和形态异常的关系，结果发现MEHP可以诱导胆固醇-脂质-类固醇代谢(CLS)增强和凋亡途径，较经典形态学改变更为敏感。因此，调控CLS代谢途径与PAEs宫内暴露导致的发育毒性相关[11]。在妊娠早期暴露DEHP体内实验中，母体肝脏中金属硫蛋白-1(metallothionein，MT-1)、金属硫蛋白-2(metallothionein，MT-2)、锌运转体蛋白(zinc transporter， ZnT-1)表达上升，而胎鼠脑组织中MT-1、MT-2和ZnT-1表达下降，因此锌代谢紊乱可能与DEHP 的胚胎毒性有关[11]。孕期DEHP暴露通过表观遗传机制影响某些维持胚胎正常发育的印记基因的表达，进而影响胚胎和胎盘发育[12]。最新的研究表明PAEs及双酚A等EEDs阻碍正常的胚胎发育，是通过影响发育的某一阶段表观遗传调控导致表型的变化，并且这些变化能够长久地遗传给后代[13-14]。实验技术手段以及医学伦理学限制了早期胚胎宫内研究，且研究主要停留在动物实验阶段，这使得EEDs对胎儿宫内发育的影响及其可能的机制知之甚少[15]。

2ESC在胚胎发育毒性研究中的应用及优势

近二十年来，随着干细胞研究方法的日臻成熟，ESC已成为发育毒性实验的一种崭新受试对象，能灵敏、准确地评价有害物质的毒性作用[16-17]。在适当的体外培养条件下，ESC能分化出包括原始外胚层、内胚层以及早期中胚层的多种细胞谱系，并产生各种细胞类型。由于缺乏空间调控信号，ESC不能完成各组织的形态发育，但能在细胞核分子水平重演胚胎发育过程，并且在胚体分化过程中，早期胚胎发育的标志基因按一定的顺序先后表达，同时各组织特异性基因的表达的顺序也很好地重演了体内胚胎发育的基因表达模式[18-19]。

评价化学物的潜在胚胎毒性和致畸性可利用ESC建立发育毒物体外预测模型。ESC具有着床前细胞特性以及细胞毒性、增殖和分化的多终点评价特性，明显提高ESC测试模型(embryonic stem cell test，EST)筛选的有效性。自2000年7月ECVAM (the European Center for the Validation of Alternative Methods)正式批准EST作为体外药物和化合物毒性筛选动物实验的替代方法，目前这种毒性检测手段已为学术界普遍接受，并且作为重要的研究手段，已经应用于毒理学研究中[20-21]。但在化学物安全评价中仍然存在实验结果外推到人的问题。

人ES细胞系(human embryonic stem cell，hESC)来自人类早期胚胎，代表人类的特征，不存在动物实验所特有的实验结果必须外推到人的问题[22]。Pal等[23]以DNA细胞周期分析、生殖层特异性标记表达和激素水平为终点评价毒物对ESC的增殖和分化的影响，从而预测毒物潜在的胚胎发育毒性。2013年，Palmer等[24]开发了一种基于hESC和代谢组学分析结合的方法，通过将hESC暴露于23种已知人类致畸物和非致畸物，然后从细胞代谢产物中鉴别出特异性的代谢产物，作为致畸性生物标志物。生物标志物具有敏感、特异、简便、无损伤等特点，筛选和利用其特性，可早期预测环境有害因素对机体的可能损害，并可评价其危险度，对于提出切实可行的预防措施有着重大意义。利用hESC和代谢组学相结合的方法去寻找发育毒性的生物标志物，对预测药物及化学物的发育毒性提供了新的思路。

ESC具有多能性和自我更新能力，一定条件下又能产生不可逆的分化。OCT-4和Nanog在保持ESC的基本特性中被认为是2个基本调节器，SOX-2通过与OCT-4组成异二聚体发挥协同调控作用。三者的表达水平和功能状态直接对ESC干性维持及生物的早期发育产生影响。

随着表观遗传学研究的深入，发现表观遗传的动态调控在ESC的自我更新和分化过程中扮演着非常重要的角色[25]。ESC在分化过程中需要经历长期不间断的基因表达过程，在这一过程中，与自我更新相关的基因是沉默的，而与细胞分化相关的特异基因被转录激活[26]。与ESC分化相关的表观遗传机制包括：DNA的甲基化、组蛋白修饰及非编码RNA。最近动物研究表明EEDs(PAEs和双酚A)宫内暴露引起的表观遗传改变可以持续在整个生命阶段诱导基因表达的改变，导致子代出生后生殖功能异常[27]；母体暴露DEHP，仔鼠睾丸DNA甲基化和DNA甲基转移酶的表达水平明显升高[26]。上述体内实验证明EEDs可以通过表观遗传机制影响胚胎发育并导致传代效应，但其分子机制尚未阐明。

3应用ESC模型研究EEDs胚胎毒性的意义

hESC作为一种新的体外受试细胞，可以替代哺乳动物的整体实验，为环境化学物的毒理研究提供丰富细胞来源。毒性物质的定性或定量实验都能够反映其对细胞生长、分化以及生物学行为的影响。由于ESC的分化通常伴随着明显的细胞形态和功能的改变，不同的组织、细胞的甲基化模式导致基因表达的特异性。此外，受外界环境的影响，甲基化的DNA更容易发生变化，进而导致基因组的不稳定，改变染色质中组蛋白的乙酰化排列方式，可能构成基因表达的另外一种编码[28]。

应用hESC作为体外实验模型来研究表观遗传影响胚胎发育是非常有价值的，因为体外hESC诱导拟胚体的形成与胚胎发育的早期阶段是非常相似的。加之，动物研究证实母体接触DEHP能影响胚胎发育，引起子代生殖功能异常，并具有传代效应[29]。值得深入研究的是：(1)EEDs如何引起在胚胎发育早期表观遗传学的改变？(2)这些改变通过什么分子靶点来影响ESC干性维持和定向分化？(3)并且对ESC造成怎样的影响？(4)这些影响又如何体现在ESC分泌产生一些小分子的生物标志物。因此，采用ESC为实验模型，分析EEDS对ESC干性维持及定向分化过程中关键基因所导致的表观遗传学影响；通过将表观遗传学理论和代谢组学技术相结合，阐明EEDs在胚胎发育早期对ESC的影响及分子机制，筛查敏感、特异、无损伤的早期生物标志物和胚胎发育毒性研究具有深远意义。

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(文敏编辑)

Research Progress of Environmental Endocrine Disruptors on Embryotoxicity by Embryonic Stem Cell Test

MA Mingyue

(School of Public Health,Shenyang Medical College,Shenyang 110034,China)

[Abstract]Animal experimental studies demonstrated that environmental endocrine disruptors(EEDs) led to embryotoxicity.The evaluation of embryotoxicity by the animal experimental has some limitation.Replacing animals experiment has become an important role in developmental toxicology.At present,embryonic stem cells have become a new subject of developmental toxicity test.And it can assess sensitively and accurately the toxic effect of xenobiotics.Embryonic stem cell test in vitro based on the characteristic of embryonic stem cell can evaluate the potential embryotoxicity and teratogenicity of EEDs.

[Key words]embryonic stem cell; environmental endocrine disruptors; embryotoxicity

[收稿日期]2016-02-05

doi:10.16753/j.cnki.1008-2344.2016.02.001

[中图分类号]R994.6

[文献标识码]A

[文章编号]1008-2344(2016)02-0065-03

[作者简介]马明月(1970—)，女(汉)，教授，博士，硕士生导师.研究方向：发育毒性与出生缺陷.E-mail：mymacmu@163.com

[基金项目]辽宁省教育厅一般项目(No.L2014414)；沈阳市科技局项目(No.F14-158-9-22)；辽宁省大学生创业计划项目(No.20141016400006)