威灵仙多糖对实验性非酒精性脂肪性肝炎大鼠血清RBP4水平和胰岛素抵抗指数的干预作用

胡敏敏，王 伟，毕洪钟，潘 金，琚 坚

昆明医科大学第二附属医院特需病房，云南 昆明 650101

威灵仙多糖对实验性非酒精性脂肪性肝炎大鼠血清RBP4水平和胰岛素抵抗指数的干预作用

胡敏敏，王 伟，毕洪钟，潘 金，琚 坚

昆明医科大学第二附属医院特需病房，云南 昆明 650101

目的 研究威灵仙多糖对非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)大鼠胰岛素抵抗的干预作用，及实验性NASH大鼠血清视黄醇结合蛋白4(retinol binding protein 4，RBP4)与胰岛素抵抗的相关性。方法 建模阶段：50只清洁级健康雄性SD大鼠随机分为空白组(n=14)和造模组(n=36)。空白组用普通饲料饲养；造模组用高脂饲料饲养，建立NASH大鼠模型。干预阶段：将造模组大鼠(n=30)随机分为模型组、易善复组和威灵仙多糖组，每组各10只；空白组大鼠(n=8)作为对照组，依次分别给予0.9% NS、易善复溶液、威灵仙多糖溶液、0.9% NS灌胃干预，8周后4组大鼠下腔静脉取血检测空腹血糖、空腹胰岛素及RBP4的含量，统计分析各组上述指标的差异及胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)与RBP4的相关性。结果 与模型组相比，威灵仙多糖组NASH大鼠HOMA-IR、血清RBP4水平较低(P<0.05)；NASH大鼠HOMA-IR与血清RBP4呈正相关(r=0.541，P=0.001)。结论 威灵仙多糖可有效治疗NASH大鼠，其主要机制之一可能是通过降低NASH大鼠血清RBP4水平，改善NASH大鼠胰岛素抵抗。

非酒精性脂肪性肝炎；视黄醇结合蛋白4；威灵仙多糖

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)以肝实质细胞脂肪变性和脂肪贮积为特征，其病程包括单纯性脂肪肝、脂肪性肝炎、脂肪性肝纤维化，最终可能演变为肝硬化或肝癌[1]。视黄醇结合蛋白4(retinol binding protein 4，RBP4)是视黄醇结合蛋白家族中的一员[2]，近年来发现RBP4是一种新的脂肪因子[3]，血清RBP4分泌增加与肝脂肪变及肝脏损伤有关，RBP4可能是NAFLD的独立相关因素[4]。

本研究旨在探讨威灵仙多糖对非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)大鼠胰岛素抵抗的干预作用，及NASH大鼠血清RBP4水平与胰岛素抵抗指数(homeostasis model assessment of insulin resistance，HOMA-IR)的相关性。

1 材料与方法

1.1 材料 清洁级健康雄性SD大鼠50只，平均体质量(70±10)g，购自昆明医科大学动物实验中心；猪油购自昆明市农贸市场；蛋黄粉、胆固醇、胆酸钠购自上海源叶生物科技有限公司；威灵仙多糖购自安徽大学生命科学院；易善复(多烯磷脂酰胆碱)购自赛诺菲(北京)制药有限公司；戊巴比妥钠购自上海西塘生物科技有限公司；甲醛购自上海远慕生物科技有限公司。

1.2 试剂 大鼠RBP4 ELISA试剂盒购自LSBio公司；大鼠胰岛素ELISA试剂盒购自ALPCO公司。

1.3 方法

1.3.1 造模阶段实验动物分组：将50只清洁级健康雄性SD大鼠随机分为空白组(n=14)和造模组(n=36)。

1.3.2 NASH大鼠模型的建立：空白组予普通饲料喂养16周；造模组予高脂饲料(饲料配比：82.5%普通饲料+10%猪油+5%蛋黄粉+2%胆固醇+0.5%胆酸钠)喂养16周。在造模期间第4周末随机选择空白组和模型组大鼠各1只、第8周末各1只、第12周末各2只、第16周末各2只，下腔静脉取血测定空腹血糖、空腹胰岛素值，根据血糖及空腹胰岛素值计算HOMA-IR；于肝右叶中央部位取适量肝组织，行HE染色后在光镜下观察肝脏脂肪变、炎症情况，统计分析空白组和模型组大鼠血清中空腹血糖、空腹胰岛素含量的差异，最后根据检测及观察的相关指标来判断实验性NASH大鼠模型是否成功建立。

1.3.3 药物干预阶段实验动物分组：实验性NASH大鼠模型成功建立后，将余下的30只造模组大鼠随机分为模型组、易善复组和威灵仙多糖组，每组各10只；余下的8只空白组大鼠作为对照组。

1.3.4 药物干预：模型组、易善复组、威灵仙多糖组、对照组依次分别予0.9% NS、易善复[195.4 mg·kg-1·d-1]、威灵仙多糖[50 mg·kg-1·d-1]、0.9% NS配成3 ml溶液，灌胃干预8周。

1.3.5 大鼠血清采集：剖杀大鼠前禁食禁饮24 h，3%戊巴比妥钠(0.1～0.15) ml/100 g行腹腔麻醉，然后下腔静脉采血测定空腹胰岛素、空腹血糖、血清RBP4水平。

1.3.6 大鼠血清指标测定：空腹血糖采用全自动生化仪检测；空腹胰岛素测定步骤严格按照大鼠胰岛素ELISA试剂盒说明书进行操作；血清RBP4测定步骤严格按照大鼠血清RBP4 ELISA试剂盒说明书进行操作。HOMA-IR=空腹血糖(mmol/L)×空腹胰岛素(mIU/L)/22.5。

1.3.7 肝脏病理结果判定：肝组织病理诊断按照肝炎组织学分级(Grade，G)、NAFLD活动度积分(NAFLD activity score，NAS)来评估。汇管区及周围、小叶内无炎症为0级(G0)；汇管区及周围炎症，小叶内变性及少数点状坏死为1级(G1)；汇管区及周围轻度碎屑坏死，小叶内变性，点、灶状坏死或嗜酸小体为2级(G2)；汇管区及周围中度碎屑坏死，小叶内融合坏死或见桥接坏死为3级(G3)；汇管区及周围重度碎屑坏死，小叶内桥接坏死广泛，累及多个小叶(多小叶坏死)为4级(G4)。NAS积分(0～8分)：(1)肝细胞脂肪变：0分(<5%)；1分(5%～33%)；2分(34%～66%)；3分(>66%)。(2)小叶内炎症(20倍镜计数坏死灶)：0分(无)；1分(<2个)；2分(2～4个)；3分(>4个)。(3)肝细胞气球样变：0分，无；1分，少见；2分，多见。NAS<3分可排除NASH，NAS>4分则可诊断NASH，介于两者之间为NASH可能。规定不伴有小叶内炎症、气球样变和纤维化但肝脂肪变>33%者为非酒精性脂肪性肝，脂肪变达不到此程度者仅称为肝细胞脂肪变。

2 结果

2.1 大鼠一般状况观察 造模阶段：造模组大鼠逐渐出现皮毛光泽度变差，活动量减少，食欲降低，大便质软、稀，饮水增多，而空白组大鼠普遍毛发光整，活动力强，进食饮水量无异常，大便性状正常。干预阶段：经灌胃干预后，易善复组、威灵仙多糖组大鼠食欲欠佳，活动力、皮毛不光整情况较模型组有所改善；但各组大鼠体质量增加都相对缓慢；对照组大鼠进食饮水量无异常、活动力正常、毛发较为光整。模型组、易善复组、威灵仙多糖组大便性状仍旧软、稀，饮水仍较多，三组间无明显差异,且与造模期间比较无明显差异；对照组大便性状正常。

2.2 各组大鼠胰岛素抵抗情况 造模阶段：随着造模时间延长，造模组HOMA-IR逐渐升高，空白组HOMA-IR未见明显升高，两组间差异有统计学意义(P<0.05，见表1)。干预阶段：采用ELISA法检测，实际测出血液样品：对照组5份、模型组8份、威灵仙多糖组10份、易善复组9份。对照组HOMA-IR与模型组HOMA-IR间的差异有显著性统计学意义(P<0.01)；威灵仙多糖组与模型组间的差异有显著性统计学意义(P<0.01)；易善复组与模型组间的差异存在显著性统计学意义(P<0.01)；对照组、威灵仙多糖组和易善复组两两比较，差异无统计学意义(P>0.05，见表2)。

表1 造模阶段空白组和造模组的HOMA-IR比较Tab 1 Comparison of HOMA-IR between blank group and building model group in modeling stage

表2 干预阶段各组的HOMA-IR比较Tab 2 Comparison of HOMA-IR among 4 groups in intervention stage

2.3 各组大鼠血清RBP4的含量 干预结束后，对照组与模型组RBP4差异有显著统计学意义(P<0.01)；威灵仙多糖组与模型组间的差异存在统计学意义(P<0.01)；易善复组与模型组间差异存在统计学意义(P<0.01)；对照组、威灵仙多糖组和易善复组两两比较差异无统计学意义(P>0.05，见表3)。

2.4 光镜下造模阶段肝脏病理学变化 造模组4周末表现为：Ⅱ度肝细胞脂肪变(NAS积分2分)，肝细胞部分气球样变(NAS积分1分)，未见炎症坏死(NAS积分0分)，NAS总积分3分；8周末表现为：Ⅳ度肝细胞脂肪变(NAS积分3分)，肝细胞较多气球样变(NAS积分2分)，部分门管区少量炎性细胞浸润及小叶内多数灶状坏死(NAS积分3分)，NAS总积分8分；12周末表现为：Ⅳ度肝细胞脂肪变(NAS积分3分)、肝细胞较多气球样变(NAS积分2分)，小叶内少数点状坏死(NAS积分2分)，NAS总积分7分；16周末表现为：Ⅳ度肝细胞脂肪变(NAS积分3分)，肝细胞较多气球样变(NAS积分2分)，部分门管区少量炎性细胞浸润及小叶内多数灶状坏死(NAS积分3分)，NAS总积分8分(见图1)。空白组4个时间点的情况类似，均未见明显肝细胞脂肪变或气球样变或炎症坏死，NAS总分为0(见图2)。

表3 各组大鼠血清RBP4含量(ng/ml)Tab 3 Levels of RBP4 in each group (ng/ml)

2.5 大鼠血清RBP4与HOMA-IR的相关性 HOMA-IR与RBP4的相关性采用Pearson相关性分析，r=0.541(P=0.001)，二者呈正相关关系(见图3)。

图1 造模组肝脏病理学变化(200×) A:4周末; B:8周末; C:12周末; D:16周末Fig 1 Pathological changes of liver in building model group (200×) A: 4 weeks; B: 8 weeks; C: 12 weeks；D： 16 weeks

图2 空白组肝脏病理学变化(200×) A:4周末; B:8周末; C:12周末; D:16周末Fig 2 Pathological changes of liver in the blank group (200×) A: 4 weeks; B: 8 weeks; C: 12 weeks；D： 16 weeks

图3 RBP4与HOMA-IR的相关性分析Fig 3 Correlation analysis of RBP4 and HOMA-IR

3 讨论

NAFLD的发病机制至今仍不明确，二次打击学说是被广泛接受的一种学说，其中首次打击就是以胰岛素抵抗为关键环节所致的肝脏脂肪变性和脂质沉积[5]。由于发病机制尚不明确，因此缺乏明确有效的长期治疗药物。威灵仙是一种常用的中药，含有皂甙类、黄酮类、生物碱类化合物、糖类等多种成分[6]。研究[7]发现，植物多糖有抗炎、抗衰老等多样的生物学功能，并参与了生物体免疫功能的调节。还有研究[8]发现，虫草多糖对免疫性肝损伤及化学性肝损伤有保护作用，党参多糖能有效降低糖尿病小鼠升高的血糖、TC、TG水平，并抑制小鼠的糖异生，调节糖脂代谢，有效改善胰岛素抵抗[9]。

RBP4是近年发现的一种新的脂肪因子，大部分RBP4是在肝脏中合成，其次为脂肪组织(占肝脏的20%～40%)，它广泛分布在人的血液、脑脊液、尿液等体液中，但血液中含量最高[10]。RBP4能激活脂肪组织中巨噬细胞的JNK信号通路，诱导巨噬细胞产生IL-6、TNF-α等促炎因子，激活脂肪组织中的炎性信号通路，阻碍正常的酪氨酸磷酸化，导致胰岛素抵抗[11]。血清中高水平RBP4可通过Toll样受体4激活巨噬细胞，产生一系列的炎症、免疫反应，激活IκB激酶(IκB kinase，IKK)，激活的IKK一方面抑制胰岛素信号转导，另一方面上调炎性因子水平，进一步通过JNK、IKK、细胞因子信号转导抑制因子3(suppressor of cytokine signaling 3，SOCS-3)形成一种低度的炎性信号环境，加速胰岛素抵抗的发展[12]。在本研究中，大鼠HOMA-IR在模型组与空白组存在差异，大鼠血清RBP4水平在模型组与空白组存在差异，HOMA-IR与RBP4呈正相关关系。说明RBP4参与了NASH的发生发展，机制可能是通过激活不同的因子、酶及相关炎症通路等，影响胰岛素对物质的代谢调节作用和胰岛素正常的信号转导，最终出现胰岛素抵抗，并导致NASH的产生。

植物多糖具有降血糖、调节血脂、免疫调节、抗炎、抗肿瘤等多种多样的药理作用[13]。本实验经过药物干预后表明：威灵仙多糖组HOMA-IR较模型组有所下降，威灵仙多糖组血清RBP4较模型组有所下降，说明威灵仙多糖可有效降低NASH大鼠的血清RBP4水平，进而改善胰岛素抵抗。本研究肯定了威灵仙多糖对NASH大鼠胰岛素抵抗的改善作用。

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(责任编辑：王全楚)

Intervention effect of polysaccharide of radix clematidis in RBP4 level and HOMA-IR of rats with non-alcoholic steatohepatitis

HU Minmin,WANG Wei,BI Hongzhong,PAN Jin,JU Jian

Department of Special Wards Branch,the Second Affiliated Hospital of Kunming Medical University,Kunming 650101,China

Objective To study the intervention effect of polysaccharide of radix clematidis (PRC) in insulin resistance of rats with non-alcoholic steatohepatitis (NASH) and the correlation between homeostasis model assessment of insulin resistance (HOMA-IR) and serum retinol binding protein 4 (RBP4) of rats with NASH. Methods Modeling stage: 14 rats were selected randomly from 50 clean healthy male SD rats and assigned to the blank group,then the remaining 36 rats were used as building model group. Blank group was reared with normal diet. Building model group was reared with high fat diet to establish the rat model of NASH. Intervention stage: after the experimental rat model of NASH establishing successfully,the remaining 30 rats of building model group were divided into model group,the polyene phosphatidyl choline (PPC) group,PRC group,randomly,each group contained 10 rats. The remaining 8 rats of blank group were used as the control group. Four groups were respectively intervened with 0.9% NS,PPC,PRC,and 0.9% NS by gavage. After 8 weeks,the fasting glucose,fasting insulin and serum RBP4 in each group were detected and the correlation of HOMA-IR and serum RBP4 was analyzed by statistical methods. Results HOMA-IR and the level of serum RBP4 in PRC group were lower than those in the model group (P<0.05). The HOMA-IR was positively related with serum RBP4 in NASH rats (r=0.541,P=0.001). Conclusion PRC is effective in treating NASH rats. The main mechanism may be improved insulin resistance of rats with NASH by reducing serum RBP4 levels.

Non-alcoholic steatohepatitis; Retinol binding protein 4; Polysaccharide of radix clematidis

云南省卫生科技厅计划项目(内设机构)(2012ws 0091)

胡敏敏，硕士，研究方向：消化系统疾病。E-mail: angiemin@sina.com

琚坚，教授，主任医师，研究方向：中西医结合方法治疗消化系统疾病。E-mail:jujianyn@163.com

10.3969/j.issn.1006-5709.2016.04.007

R575.5

A

1006-5709(2016)04-0386-05

2015-09-15