蜜蜂主要病害及其病原PCR检测研究进展

刘学录 童金凤 马振刚

摘要：蜜蜂疾病已成为制约蜂产品产量提高和蜂产品安全的重要因素，引起蜜蜂疾病的病原种类很多，包括细菌型、真菌型、病毒型及寄生虫类病害等。文章通过综述蜜蜂蜂群中四类主要病害（细菌型病害、真菌型病害、病毒型病害和寄生虫类病害）的致病病原、病症及其PCR检测方法，发现由于某些相似病原体间的基因序列具有高度保守性，在实际诊断过程中仍然存在缺乏PCR鉴定靶标、PCR检测假阳性等问题。因此，今后应着眼于以下几点，有效解决蜜蜂疾病快速、特异诊断的障碍：（1）筛选单一病原体的特异候选靶标基因，提高PCR检测结果的特异性；（2）设计并优化针对特异基因片段的引物序列，降低引物错配率；（3）基于先进的病原检测方法，建立灵敏度更高的疾病诊断方法；（4）完善LAMP、ELISA、免疫试纸条法等在蜜蜂疾病诊断中的应用。

关键词： 蜜蜂；主要病害；症状；PCR检测

中图分类号： S895 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2016）01-0147-06

0 引言

蜜蜂是一类重要的经济昆虫，在构建与维持自然生态系统和生态农业、供给人类高级营养和保健功能产品的过程中扮演重要角色（Ren et al.，2014）。我国是养蜂大国，也是世界蜂产品生产和出口大国，每年出口的蜂蜜数量占世界出口总量的20%左右，年均出口创汇达1.4亿美元。同时，蜜蜂已经成为一种世界性的重要的经济模式生物。据联合国粮食及农业组织（FAO）不完全统计，20世纪60～90年代世界蜜蜂种群数量一直呈上升趋势（陈黎红等， 2012）。但蜜蜂在生存过程中，易受各类外界条件威胁，其中蜜蜂传染性病虫害因危害程度严重、传播迅速、持续时间长等特点，已成为制约蜂产品产量提高和蜂产品安全的重要因素。世界动物卫生组织（OIE）也将蜜蜂病定为B类法定报告疾病（曹联飞等，2006）。在蜂业生产过程中，引起蜜蜂疾病的病原种类很多，包括细菌型、真菌型、病毒型病害等。蜜蜂受到疾病威胁，不仅导致其大量死亡而影响蜂群的生产能力，还伴有传染性病原微生物污染，蜂产品卫生质量受到影响；此外，在疾病防治过程中常因用药不当致使药物残留，造成蜂产品的双重污染。传统的蜜蜂疾病诊断主要依靠肉眼观察患病蜜蜂的病症及电镜观察分离、纯化获得的病原，其方法耗时长、操作繁琐且不易进行明确区分，如患欧洲幼虫腐臭病和中蜂囊状幼虫病毒的蜜蜂均可出现“插花子脾”现象。新兴的PCR分子检测技术是在分子水平上，针对不同种病原的分子特异性片段进行扩增鉴定，具有快速、方便、准确等优势，一直受到蜜蜂疾病诊断研究者的广泛关注。为此，本文通过综述蜜蜂主要病害及其病原PCR检测的研究进展，以期为蜜蜂疾病诊断及病原体快速鉴定方法的建立提供参考依据。

1 细菌型疾病

细菌型疾病是一种严重危害蜜蜂蜂群正常生长、发育的传染性疾病，具有感染时间长、传播速度快、危害程度大等特点。目前比较具有代表性的蜜蜂细菌型疾病包括：美洲幼虫腐臭病、欧洲幼虫腐臭病、成蜂螺原体病、败血病和副伤寒杆病，对应的主要致病病原分别是类幼虫芽孢杆菌、蜂房蜜蜂球菌、螺原体、蜜蜂败血假单胞菌和蜂房哈夫尼菌。美洲幼虫腐臭病和欧洲幼虫腐臭病属于蜜蜂幼虫病，患美洲幼虫腐臭病的蜜蜂最初会在体色上发生明显变化，颜色由正常的珍珠白变为棕黄色、褐色甚至黑褐色，房盖由凸起变为凹陷，且潮湿、颜色变暗，整个房盖颜色交错，感染后期用镊子挑起虫尸可拉成2～3 cm的细丝，且伴有鱼腥臭味（Shimanuki et al.，1980；张其安等，2011）；而患欧洲幼虫腐臭病的幼虫体色先呈苍白色，逐渐变化为黄色，最后呈深褐色，并且可见白色窄条状背线，死尸无黏稠性但有酸臭味，易被工蜂清除掉而留下空房，其与子房相间形成“插花子脾”现象（孙希国，2014）。蜂螺原体病、败血病和副伤寒杆病属于成蜂病，患成蜂螺原体病的蜜蜂行动缓慢，失去飞翔能力，常见三五成群聚集在土洼或草丛中；患败血病蜜蜂的典型症状是染病初期成蜂拒食、烦躁不安、无力飞翔、爬行于箱内外、振翅，最后抽搐、痉挛而死，病死的蜜蜂变色、变软、腐烂，直至肢节分离（彭文君等，2014）；患副伤寒杆病的病蜂多表现出“大肚型”：患病蜂腹部膨大、虚弱、行动迟缓、无飞翔能力、部分肢节麻痹、下痢，有时也会存在“油光黑蜂型”：病蜂绒毛脱落，头腹部缩小且似油炸般（洪德兴，2000）。

在养蜂生产过程中，蜂业工作者通常使用四环素类抗生素（TCs）对蜜蜂败血病或美洲幼虫腐臭病等细菌型疾病进行预防和治疗，进而造成蜂产品中TCs药物残留。如利用羟四环素（Oxytetracycline，OTC）可实现对美洲幼虫腐臭病的有效控制，但蜂群储蜜须经多次摇除后才能有效将OTC残留量降低到一个相对较低的标准。2002年初，我国蜂产品因氯霉素等抗生素残留超标而被禁止出口欧盟。因此有必要加快并实现蜜蜂幼虫病的快速诊断，减少抗生素等药物的使用。至今，针对蜜蜂主要细菌性疾病的PCR检测方法已初步建立（表1），如欧洲幼虫腐臭病可根据针对Melissococcus pluton的16S rRNA基因设计特异性引物开展诊断，其引物特异性强，不与其他DNA产生杂交反应（Govan et al.，1998）；针对蜜蜂螺原体（Spiroplasma melliferum）也建立了一种PCR快速检测方法，其最低检测浓度为5～6个/mL（李霞，2012）；针对美洲幼虫腐臭病检测则建立了更精确的二温式PCR检测方法，其检测幼虫芽孢杆菌的DNA灵敏度达33 fg，且重复性良好（何晓杰等，2015）；而针对副伤寒杆病，是根据甲型副伤寒沙门菌鞭毛抗原特異性基因DNA核苷酸序列设计特异性上、下游引物及荧光探针序列（冉燕，2009）。

2 真菌型疾病

真菌型疾病是一种严重影响蜜蜂蜂群发展的顽固性传染病，其发生与多雨、潮湿、温度不稳定有关，且多见于西方蜜蜂，如白恶病、黄曲霉病均可引起蜜蜂幼虫死亡。蜜蜂白垩病又名石灰质病，是由蜜蜂球囊菌（Ascosphaeraapis）引起蜜蜂幼虫死亡的真菌型传染病（赵红霞等，2014）；黄曲霉病又称结石病或石蜂子病，是一种由黄曲霉菌引起的蜜蜂传染病。一般4日龄蜜蜂幼虫极易感染蜜蜂白垩病，且雄蜂幼虫较工蜂更易感染，患病幼虫常出现虫体膨胀特征并长出白色绒毛充满于整个巢房（Maxfield-Taylor et al.，2015），虫体多呈六边形状，患病后期萎缩干枯、褶皱、变硬发白或呈黑褐色（赵柏林，2007）。蜜蜂幼虫、蛹和成年蜂均易受黄曲霉病感染，但常见于幼虫和蛹，该病多发生在夏秋多雨季节；幼虫和蛹死亡后先呈苍白色，之后逐渐变干、变硬，表面长满白色菌丝和黄色带点绿的孢子（陈晓云，2013a），且充满巢房，輕微振动则孢子四处飞散；成年蜂染病后，一开始表现不安宁，之后变得虚弱无力，常爬出巢房外死亡。

蜜蜂真菌型疾病频繁发生，严重阻碍了养蜂业的快速发展。目前，针对蜜蜂真菌型疾病的PCR检测方法也有报道（表2）。蜜蜂白垩病诊断是选择蜜蜂球囊菌的ITS1、ITS2和5.8S rDNA保守序列（U68313）为靶标，建立TaqMan探针荧光PCR检测法，其灵敏度为1 ng/μL（宋战昀等，2010a）。针对黄曲霉菌检测，可以参考基于alfP基因的巢氏PCR（Nested-PCR），其特异性较高（刘裴清等，2015）。

3 病毒型疾病

病毒型疾病是由蜜蜂病毒引起的传染性疾病，其病原主要属于肠道病毒属和虹彩病毒属。低浓度的蜜蜂病毒可长期以无明显发病症状的感染方式停留在蜜蜂体内，一旦在特定环境条件下被激发，将会表现出强烈的致病性而引起蜜蜂快速死亡。目前，蜜蜂病毒病主要包括中蜂囊状幼虫病、蜜蜂急性麻痹病、蜜蜂慢性麻痹病、蜜蜂克什米尔病毒病、蜜蜂黑蜂王台病毒病、蜜蜂卷翅病毒病和蜜蜂以色列急性麻痹病毒病等。

近年来，中蜂囊状幼虫病在养蜂区经常暴发，严重影响了我国中蜂产业的发展。引起囊状幼虫病的病原是肠道病毒属的囊状幼虫病毒（Chinese sac brood virus，CSBV），属于正链单股小核糖核酸病毒，对蜂群危害极其严重，且中华蜜蜂较西方蜜蜂更易感病；发病初期无明显症状，中期幼虫背部呈棕色斑点，并逐渐变成暗灰色，皮下渗出液增多且略带黄色，形似水袋；发病后期，子脾上既有死蛹也有健康蛹，出现“插花子脾”现象（李薇等，2014）。蜜蜂急性麻痹病是由肠道病毒属的急性蜜蜂麻痹病毒（Acute bee paralysis virus，ABPV）所引起；该病毒主要侵害蜜蜂的神经系统，且在35 ℃下致病性最强；染病的成年工蜂表现出麻痹症状，失去飞行能力，离巢后快速死亡。与蜜蜂急性麻痹病不同，蜜蜂慢性麻痹病的病原是慢性蜜蜂麻痹病病毒（Chronic bee paralysis virus，CBPV）。CBPV是一种正链单链RNA病毒，由两段长度分别为3647个碱基（RNA1）和2305个碱基（RNA2）的RNA单链构成，主要侵袭成年工蜂，感染的蜂群可能同时出现Ⅰ型和Ⅱ型两种典型的麻痹病症。Ⅰ型麻痹综合症表现为患病蜜蜂身体和双翅不正常振颤、双翅常无法闭合，失去飞行能力；Ⅱ型麻痹综合症又称“黑盗蜂”、“脱毛黑蜂症”或“黑小蜂”等，患病蜜蜂个体初期具备飞行能力，身体绒毛逐渐脱落，体色加深变黑。蜜蜂克什米尔病是由蜜蜂克什米尔病毒（Kashmir bee virus，KBV）引起，目前该病毒已先后在东方蜜蜂和西方蜜蜂体内被发现；感染初期无明显发病症状，一旦有少数病毒颗粒进入蜜蜂淋巴液后，便可在短时间内大量繁殖复制，病毒浓度急剧增加，最终导致染病蜜蜂在3 d内死亡。蜜蜂黑蜂王台病毒（Black queen cell virus，BQCV）是引起蜜蜂黑蜂王台病毒病的病原，该病毒已经在欧洲、北美和澳大利亚鉴定出；主要危害蜂王的幼虫和蛹，春季和初夏为发病高峰期，其典型症状为患病幼虫体色变黄，表皮逐渐硬化成一皮囊；发病蜂蛹体色变暗，快速死亡，甚至王台内壁被染呈棕色或黑色（张炫等，2012）。蜜蜂卷翅病毒病是由蜜蜂卷翅病毒（Deformed wing virus，DWV）所引起，发病成蜂的双翅卷曲变皱，身体萎缩，体色变暗，只能爬行，失去飞行能力，羽化后1～2日内死亡（Ribière et al.，2002）。以色列急性麻痹病毒（Israeli acute paralysis virus，IAPV）是一种广泛传播于蜜蜂群体间的RNA病毒，此病毒可侵染任意发育时期的蜜蜂，蜜蜂感染初期，其腹部、胸部逐渐变黑，既不采食也不飞行，不停地在蜂箱外空地上转圈，后期胸部绒毛脱落，麻痹、抽搐而死（Maori et al.，2007）；也有研究初步证实，该病毒可能是导致蜂群崩溃失调症（Colony collapse disorder，CCD）的最大影响因素，因此备受关注。

蜜蜂病毒病属于暴發性传染病，因此前期的蜂病监测具有重要意义。至今，针对蜜蜂中蜂囊状幼虫病的诊断研究较多，常规RT-PCR和环介导等温扩增（LAMP）两种检测方法均已被推广应用于CSBV检测，且对比发现LAMP診断结果更快速、特异，其检测最低限度为1 pg（Ma et al.，2011）；基于TaqMan探针的荧光PCR检测方法也被应用于CSBV检测，其检测灵敏度为1.0×102拷贝/μL（宋战昀等，2010a）。在针对ABPV、CBPV、KBV、BQCV、DWV和IAPV的检测中，RT-PCR检测方法已比较成熟，均能特异地扩增获得靶基因（表3），为蜜蜂病毒病的快速检测提供了技术支持。

4 寄生虫类疾病

寄生虫类疾病是因寄生虫寄生于蜜蜂宿主而引起的传染性疾病，主要通过侵染蜜蜂不同部位及摄取蜜蜂体内营养物质而最终导致蜜蜂组织崩溃。目前较常见的寄生虫病包括蜜蜂微孢子虫病、阿米巴病和蜂螨病。感染寄生虫后的蜜蜂均表现出体质衰弱，蜂群发展缓慢，已逐渐成为制约蜂产业发展的主要病害。

蜜蜂微孢子虫病（Microsporidiosis）又称蜜蜂微粒子病，其病原为蜜蜂微孢子虫（Nosemaapis），主要寄生于中肠组织，受感染的蜜蜂因维持稳态和组织更新等相关基因受到严重抑制而引发组织崩溃；患病初期无明显外部症状，且飞行正常；患病后期，蜜蜂个体瘦小，反应迟钝，萎靡不振，两翅散开不相连，且蛰刺反应丧失，腹部1～3节背板呈深棕色，前胸背板和腹尖变黑，多爬伏在框梁或蜂箱前草地上。阿米巴病是由蜜蜂马氏管变形虫（Malipighamoeba mellificae）侵袭成蜂马氏管所引起的一种传染病，患病蜂群发展缓慢，群势逐渐减弱，但在群内及蜂箱周围很少见到死蜂；病蜂腹部膨大，有时出现下痢症状，体质衰弱，无力飞行，不久死亡；取病死蜜蜂镜检，发现马氏管膨大，近似透明状，且管内充满珍珠样的包囊（彭文君等，2014）。螨虫寄生是蜜蜂最主要的病害之一，目前已发现有7种蜂螨，其中以大蜂螨、小蜂螨及武氏蜂盾螨对养蜂业的危害较大。大蜂螨常寄生于蜂体胸、翅、足基部，感染后蜜蜂蜂体衰弱，采集力下降，寿命减短，成年工蜂烦躁不安，四处乱爬，无法正常飞行；小蜂螨常寄生于幼虫体内，多在子脾上活动（陈晓云，2013b），感染后蜜蜂幼虫表皮破裂，呈乳白色或浅黄色，可造成比大蜂螨更严重的“烂子”现象（彭文君等，2014）。

为了更好地诊断蜜蜂寄生虫病，有关学者也在积极寻找更简便、快速的检测方法（表4）。对于蜜蜂微孢子虫病，已针对西方蜜蜂微孢子虫16S rRNA基因（U26534，GI857487）、小亚基单位核糖体DNA（16S rDNA）及核糖体转录间隔区（ITS）基因序列的高度特异区域设计了特异性引物，经PCR扩增可成功获得特异的DNA片段（何超，2014）。在蜜蜂阿米巴病检测研究中，环介导等温扩增方法（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）已被报道，是根据阿米巴变形虫（Entamoeba histolytica）的HYL6基因设计LAMP引物，其检测灵敏度可达15.8 ng/μL（Rivera and Ong，2013）。

5 展望

在蜂业生产过程中及时检测并正确区分疾病病原，对有效阻断病原传播、保障蜂产品安全具有重要意义。PCR作为新一代的病原检测技术，是以病原微生物特异、保守的DNA/RNA分子序列为检测靶标，通过设计特异性引物进行扩增，具有误差小、方法简单、操作便捷、特异性强等特点，可针对病原进行一对一地检测，极大提高了对蜜蜂疾病的诊断效率。由于某些相似病原体间的基因序列具有高度保守性，因此在实际诊断过程中仍然存在缺乏PCR鉴定靶标、PCR检测假阳性等问题。随着现代基因与转录组高通量测序技术的高速发展，今后应着眼于以下几点，有效解决蜜蜂疾病快速、特异诊断的障碍：（1）基于已测序的蜜蜂病原体基因与转录组数据，通过比较基因组学分析方法，筛选单一病原体的特异候选靶标基因，提高PCR检测结果的特异性，避免交叉扩增，进而确保诊断结果更准确；（2）设计并优化针对特异基因片段的引物序列，降低引物错配率，提高PCR扩增结果的准确性和可信性；（3）基于先进的病原检测方法，如实时定量RT-PCR（qRT-PCR）、TaqMan探针、电化学检测、LAMP等，建立灵敏度更高的疾病诊断方法；（4）完善LAMP、ELISA、免疫试纸条法等在蜜蜂疾病诊断中的应用，促使蜜蜂疾病诊断更加快速便捷。

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（責任編辑 兰宗宝）