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MADS—box基因在小麦幼胚脱分化过程中的差异分析

2016-05-30刘海霞莫海江程玉红马洪波夏海东洪伟董红星陈军营

山东农业科学 2016年3期
关键词:基因芯片小麦

刘海霞 莫海江 程玉红 马洪波 夏海东 洪伟 董红星 陈军营

摘要:本研究首次在小麦幼胚脱分化过程中利用Affymetrix小麦基因芯片技术对MADS—box基因表达变化进行检测,共检测到20个MADS-box基因,其中14个基因下调表达,6个基因混合表达。这些基因大量下调表达,推测其在小麦幼胚脱分化中具有较强的抑制作用。此外发现,12 h是小麦幼胚脱分化过程中MADS-box基因表达的一个关键时期。选取CA670406、CK213813、CA608865和AB107992四个基因进行半定量RT-PCR验证,检测结果与小麦基因芯片结果基本一致。

关键词:小麦;MADS-box基因;基因芯片;幼胚;脱分化

中图分类号:S512.101:Q786 文献标识号:A 文章编号:1001—4942(2016)03—0009—05

MADS-box基因是由酵母中的MCM1、拟南芥中的AG、金鱼草中的DEFICIENS和人类中的SRF4种MADS-box基因的首字母缩写而成。MADS-box基因家族是一类序列特异的多基因家族,其所编码的MADS-box蛋白即为MADS-box转录因子,它以多聚体的形式通过其保守结构域与特定的DNA序列结合来调控基因表达,其主要功能表现为激活或抑制靶基因的转录反应。在许多植物基因组中存在数量不等的MADS-box重复基因,研究较早较多的植物是拟南芥、金鱼草和矮牵牛,之后在水稻、油菜、罂粟、豌豆、番茄、葡萄、玉米、小麦等多种植物中也发现了MADS-box基因的存在。MADS-box基因具有多种生物学功能,它不仅与植物花器官的发育、花时的调控以及其它生殖生长过程有关,而且也在根的形成、叶的生长和植物抗逆反应中起作用,其中,在拟南芥根部表达的MADS—box基因至少有50个。随着研究的深入,人们对MADS—box基因的研究逐渐拓展到小麦上来。研究发现,TaVRT-1基因在春化诱导的植物中表达,该基因Vrn-1区域与春化处理和耐冬性有关。TaMADS#11是TaVRT-1的一个同源基因,同样具有促进营养生长向生殖生长转变的功能。WP11和WP12是小麦中分离出来的两个与心皮化有关的基因,表达部位集中在小花浆片原基和雄蕊原基,该基因属于B组PI亚家族基因。TaMADS#82是一个与WP11表达模式相似的基因。此外发现,WAG基因与小麦幼穗发育有关,VRNl和VRN2基因与小麦开花结实相关。MADS-box基因的研究虽然有增多趋势,但在小麦中的研究仍处于起步阶段,对小麦幼胚脱分化过程的研究至今尚未见报道。

本试验用豫麦18幼胚为材料,在2,4-D诱导条件下进行脱分化处理,结合基因芯片技术,检测不同时间点MADS-box基因的差异表达情况,对揭示它们在小麦幼胚脱分化过程中的作用具有重要的参考意义。

1材料与方法

1.1试验材料

利用豫麦18作为试材,于小麦授粉后16 d采集幼穗在无菌条件下剥取幼胚,放置于MS+2,4-D(2 mg/L)培养基上进行培养,分别于脱分化处理0、2、6、12、24、72 h时取样,用液氮处理,-70%低温冰箱中保存备用。

1.2试验方法

1.2.1小麦幼胚总RNA的提取 总RNA的提取按QIAGEN公司的RNeasy Mini Kit试剂盒操作程序进行。总RNA纯化按QIAGEN公司的RNeasy mini试剂盒操作程序进行。用DEPC处理过的ddH20溶解RNA,琼脂糖凝胶电泳(180V,0.5 h)对总RNA 28S和18S比例进行检测,在260/280 nm波长下测定总RNA的吸光值,计算其浓度和纯度。

1.2.2小麦幼胚cDNA、cRNA的合成与纯化按照Affymetrix公司方法进行cDNA、cRNA合成。eDNA合成需取1~8μg总RNA作为模板。生物素标记的eRNA合成需取12μL上述eDNA溶液作为模板。按基因芯片分析样品纯化操作程序对cDNA、cRNA进行纯化。按1.2.1方法对cDNA、eRNA浓度、纯度和质量进行检测。1.2.3

小麦幼胚cRNA片段化和芯片检测

在1.5 mL无RNA酶、灭菌的离心管中加入浓度为1μg/μL的cRNA 15 μL,5×片段化缓冲液6 μL,无RNA酶水9μL,将体系混匀,94℃温浴35min,冰上放置,获得长度为35~200 bp的cRNA片段。杂交液的配制按Affymetrix公司提供的配方进行,再将其加入到经过预杂交处理的Affy—metrix Wheat Gene Chip中,45℃、60 r/min杂交16 h。采用全自动洗涤工作站450(Affymetrix公司,USA)对基因芯片进行洗涤和染色,采用高分辨芯片扫描仪3000(Affymetrix公司,USA)对基因芯片进行扫描,获得各基因不同时间点的表达信号值。

1.2.4小麦幼胚基因芯片检测参数的获取信号值的读取、处理采用GCOSl.2软件,并对获取的信号值、信号检出(P,A,M)以及试验与对照组问的比值进行归一化处理。

1.2.5小麦幼胚基因芯片MADS—box家族基因的确认

通过NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)、DATF(datf.cbi.pku.edu.cn)和DRTF(drtf.cbi.pku.edu.cn)等网站在拟南芥和水稻等植物数据库中查找MADS—box家族相关基因的名称,根据基因名称在小麦基因芯片上查找相应名称,获取各时间点的荧光信号值。计算不同时间点荧光信号值与0 h(对照)荧光信号值的比值,并算出各比值以2为底的对数,当对数值小于-1为有意义下调差异表达,当对数值大于+1为有意义上调差异表达。

1.2.6 MADS-box基因半定量RT-PCR验证

利用反转录生成的cDNA为模板,用β-actin作为内参,从MADS-box家族基因中抽取CA670406等4个基因进行半定量RT-PCR验证。PCR反应体系:模板DNA 1.0 μL,10×Buffer5.0 iμL,2.5 mmol/L dNTP 4.0 μL,25 mmol/LMgCl23.0 μL,20 μmol/L上下游引物各1.25 μL,5 U/μL Taq酶0.2μL,ddH2O加至50 μL。PCR反应条件:95℃预变性5 min,94℃变性30 s,55~57℃退火30 s,72℃延伸30 s,35个循环;72℃延伸5 min,4℃保存。取5μL反应产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳检测。引物序列及扩增产物长度见表1。

2结果与分析

2.1 MADS-box基因家族中PI亚族基因的表达分析

编码花器官相关转录因子PI(HSTILLATA protein)的基因属于花发育ABC模型中的B类基因,在花瓣、雄蕊的形成中发挥作用。在小麦幼胚脱分化过程中,检测到的PI转录因子基因在12~24 h下调表达,其靶基因WP11(AB107991)和WPI2(AB107992)分别在12、72 h和6~24 h下调表达(图1)。推测在小麦幼胚脱分化过程中,PI转录因子基因及其靶基因具有一定的抑制作用。

2.2 MADS—box基因家族中AG亚族基因的表达分析

参与决定雄蕊、心皮、花分生组织形成的相关转录因子AG(Floral homeotic protein)基因的研究较早出现在拟南芥和金鱼草中,之后发现该类基因在小麦成熟胚脱分化过程中表达。在小麦幼胚脱分化过程中,也发现一个编码AG的基因CA658343,其在12、72 h下调表达。具有独立促进心皮分化功能的靶基因SPT(SPATULA)有4个成员(CK213813、BE417035、CA608865、BJ272559),BJ272559仅在12 h有意义下调表达;BE417035在12 h下调,24~72 h转为上调;CK213813、CA608865在2~6 h上调,12 h转为下调,24~72h上调(图1)。

2.3 MADS-box基因家族中AGL9亚族基因的表达分析

在小麦幼胚脱分化过程中,发现编码调节外界信号反应蛋白AGL9的5个基因(BJ221584、BJ276784、CA726603、CD374109、CN009238,图1)。这5个基因在幼胚脱分化过程中均呈下调表达趋势,其中在2、12 h全部下调。靶基因AG有一个成员(CA658343),仅在12、72 h表达。靶基因fbp2编码果糖-1,6-二磷酸酶(fructose-1,6-bisphosphatase),有两个成员(CD894372、CA686703),其中,CD894372在2~6、24~72 h上调表达,在12 h下调表达,CA686703仅在6~12h下调表达。

2.4 MADS—box基因家族中CO亚族基因的表达分析

CO亚族基因编码开花时间早晚的成花计时相关转录因子,其转录的mRNA达到一定域值时可显著地促进靶基因LFY的表达。本试验编码转录因子CO的有4个基因(BE442521、BG906984、CA670406、CA730918),在小麦幼胚脱分化过程中呈下调趋势,12 h时下调幅度最大,推测这4个基因在12 h抑制作用最强。其中,BG906984在2~72 h均下调。靶基因LFY(CD911368)在12 h下调(图1)。推测在小麦幼胚脱分化过程中,转录因子CO基因对其靶基因LFY(CD911368)可能具有一定的促进作用。

2.5 RT-PCR检测MADS-box基因芯片数据的可靠性

根据小麦基因芯片信号值的高低,抽取CA670406、CK213813、CA608865和AB107992共4个MADS-box基因进行RT-PCR检测(以β-actin内参作为对照),对基因芯片数据可靠性进行验证。经比较可知,小麦基因芯片结果与RT—PCR检测结果基本一致,说明Affymetrix小麦基因芯片数据相对可靠。

3结论与讨论

MADS-box基因的生物学功能非常丰富,但前人研究内容主要侧重于植物生殖生长如花器官发育、种子发育、果实发育等方面,研究对象主要集中于拟南芥、水稻等植物。本试验在对小麦成熟胚脱分化中MADS-box基因的表达进行分析的基础上,对小麦幼胚脱分化中MADS-box基因的表达变化进行研究,证明MADS-box基因不仅在小麦成熟胚脱分化中表达,而且也在小麦幼胚脱分化中表达,拓宽了MADS-box家族基因在小麦中的表达范围。此外,本研究再次证明MADS-box基因在生理学上具有分化、脱分化双重功能。本试验共研究了20个MADS-box基因的表达变化,这些基因整体以下调表达为主,其中下调表达基因共14个,混合表达基因6个,表明小麦幼胚脱分化过程是一个受多个MADS-box基因控制的复杂的调控过程。这些基因大量下调表达,推测它们在幼胚脱分化中抑制作用相对较强。在小麦幼胚脱分化的各个时期,20个MADS-box基因在12 h均下调,其中19个基因的下调值是对照值的15倍,表明12 h是MADS-box基因大量表达的一个关键时期。此外,MADS-box基因在幼胚脱分化中发生上调的有6个,表达强度变化较小,上调值达到对照3.7倍的仅有CD894372、BE417035、CK213813这3个基因,推测这些基因在小麦幼胚脱分化过程中具有一定的促进作用。

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