MADS—box基因在小麦幼胚脱分化过程中的差异分析

刘海霞 莫海江 程玉红 马洪波 夏海东 洪伟 董红星 陈军营

摘要：本研究首次在小麦幼胚脱分化过程中利用Affymetrix小麦基因芯片技术对MADS—box基因表达变化进行检测，共检测到20个MADS-box基因，其中14个基因下调表达，6个基因混合表达。这些基因大量下调表达，推测其在小麦幼胚脱分化中具有较强的抑制作用。此外发现，12 h是小麦幼胚脱分化过程中MADS-box基因表达的一个关键时期。选取CA670406、CK213813、CA608865和AB107992四个基因进行半定量RT-PCR验证，检测结果与小麦基因芯片结果基本一致。

关键词：小麦；MADS-box基因；基因芯片；幼胚；脱分化

中图分类号：S512.101：Q786 文献标识号：A 文章编号：1001—4942（2016）03—0009—05

MADS-box基因是由酵母中的MCM1、拟南芥中的AG、金鱼草中的DEFICIENS和人类中的SRF4种MADS-box基因的首字母缩写而成。MADS-box基因家族是一类序列特异的多基因家族，其所编码的MADS-box蛋白即为MADS-box转录因子，它以多聚体的形式通过其保守结构域与特定的DNA序列结合来调控基因表达，其主要功能表现为激活或抑制靶基因的转录反应。在许多植物基因组中存在数量不等的MADS-box重复基因，研究较早较多的植物是拟南芥、金鱼草和矮牵牛，之后在水稻、油菜、罂粟、豌豆、番茄、葡萄、玉米、小麦等多种植物中也发现了MADS-box基因的存在。MADS-box基因具有多种生物学功能，它不仅与植物花器官的发育、花时的调控以及其它生殖生长过程有关，而且也在根的形成、叶的生长和植物抗逆反应中起作用，其中，在拟南芥根部表达的MADS—box基因至少有50个。随着研究的深入，人们对MADS—box基因的研究逐渐拓展到小麦上来。研究发现，TaVRT-1基因在春化诱导的植物中表达，该基因Vrn-1区域与春化处理和耐冬性有关。TaMADS#11是TaVRT-1的一个同源基因，同样具有促进营养生长向生殖生长转变的功能。WP11和WP12是小麦中分离出来的两个与心皮化有关的基因，表达部位集中在小花浆片原基和雄蕊原基，该基因属于B组PI亚家族基因。TaMADS#82是一个与WP11表达模式相似的基因。此外发现，WAG基因与小麦幼穗发育有关，VRNl和VRN2基因与小麦开花结实相关。MADS-box基因的研究虽然有增多趋势，但在小麦中的研究仍处于起步阶段，对小麦幼胚脱分化过程的研究至今尚未见报道。

本试验用豫麦18幼胚为材料，在2，4-D诱导条件下进行脱分化处理，结合基因芯片技术，检测不同时间点MADS-box基因的差异表达情况，对揭示它们在小麦幼胚脱分化过程中的作用具有重要的参考意义。

1材料与方法

1.1试验材料

利用豫麦18作为试材，于小麦授粉后16 d采集幼穗在无菌条件下剥取幼胚，放置于MS+2，4-D（2 mg/L）培养基上进行培养，分别于脱分化处理0、2、6、12、24、72 h时取样，用液氮处理，-70%低温冰箱中保存备用。

1.2试验方法

1.2.1小麦幼胚总RNA的提取 总RNA的提取按QIAGEN公司的RNeasy Mini Kit试剂盒操作程序进行。总RNA纯化按QIAGEN公司的RNeasy mini试剂盒操作程序进行。用DEPC处理过的ddH20溶解RNA，琼脂糖凝胶电泳（180V，0.5 h）对总RNA 28S和18S比例进行检测，在260/280 nm波长下测定总RNA的吸光值，计算其浓度和纯度。

1.2.2小麦幼胚cDNA、cRNA的合成与纯化按照Affymetrix公司方法进行cDNA、cRNA合成。eDNA合成需取1～8μg总RNA作为模板。生物素标记的eRNA合成需取12μL上述eDNA溶液作为模板。按基因芯片分析样品纯化操作程序对cDNA、cRNA进行纯化。按1.2.1方法对cDNA、eRNA浓度、纯度和质量进行检测。1.2.3

小麦幼胚cRNA片段化和芯片检测

在1.5 mL无RNA酶、灭菌的离心管中加入浓度为1μg/μL的cRNA 15 μL，5×片段化缓冲液6 μL，无RNA酶水9μL，将体系混匀，94℃温浴35min，冰上放置，获得长度为35～200 bp的cRNA片段。杂交液的配制按Affymetrix公司提供的配方进行，再将其加入到经过预杂交处理的Affy—metrix Wheat Gene Chip中，45℃、60 r/min杂交16 h。采用全自动洗涤工作站450（Affymetrix公司，USA）对基因芯片进行洗涤和染色，采用高分辨芯片扫描仪3000（Affymetrix公司，USA）对基因芯片进行扫描，获得各基因不同时间点的表达信号值。

1.2.4小麦幼胚基因芯片检测参数的获取信号值的读取、处理采用GCOSl.2软件，并对获取的信号值、信号检出（P，A，M）以及试验与对照组问的比值进行归一化处理。

1.2.5小麦幼胚基因芯片MADS—box家族基因的确认

通过NCBI（www.ncbi.nlm.nih.gov）、DATF（datf.cbi.pku.edu.cn）和DRTF（drtf.cbi.pku.edu.cn）等网站在拟南芥和水稻等植物数据库中查找MADS—box家族相关基因的名称，根据基因名称在小麦基因芯片上查找相应名称，获取各时间点的荧光信号值。计算不同时间点荧光信号值与0 h（对照）荧光信号值的比值，并算出各比值以2为底的对数，当对数值小于-1为有意义下调差异表达，当对数值大于+1为有意义上调差异表达。

1.2.6 MADS-box基因半定量RT-PCR验证

利用反转录生成的cDNA为模板，用β-actin作为内参，从MADS-box家族基因中抽取CA670406等4个基因进行半定量RT-PCR验证。PCR反应体系：模板DNA 1.0 μL，10×Buffer5.0 iμL，2.5 mmol/L dNTP 4.0 μL，25 mmol/LMgCl₂3.0 μL，20 μmol/L上下游引物各1.25 μL，5 U/μL Taq酶0.2μL，ddH₂O加至50 μL。PCR反应条件：95℃预变性5 min，94℃变性30 s，55～57℃退火30 s，72℃延伸30 s，35个循环；72℃延伸5 min，4℃保存。取5μL反应产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳检测。引物序列及扩增产物长度见表1。

2结果与分析

2.1 MADS-box基因家族中PI亚族基因的表达分析

编码花器官相关转录因子PI（HSTILLATA protein）的基因属于花发育ABC模型中的B类基因，在花瓣、雄蕊的形成中发挥作用。在小麦幼胚脱分化过程中，检测到的PI转录因子基因在12～24 h下调表达，其靶基因WP11（AB107991）和WPI2（AB107992）分别在12、72 h和6～24 h下调表达（图1）。推测在小麦幼胚脱分化过程中，PI转录因子基因及其靶基因具有一定的抑制作用。

2.2 MADS—box基因家族中AG亚族基因的表达分析

参与决定雄蕊、心皮、花分生组织形成的相关转录因子AG（Floral homeotic protein）基因的研究较早出现在拟南芥和金鱼草中，之后发现该类基因在小麦成熟胚脱分化过程中表达。在小麦幼胚脱分化过程中，也发现一个编码AG的基因CA658343，其在12、72 h下调表达。具有独立促进心皮分化功能的靶基因SPT（SPATULA）有4个成员（CK213813、BE417035、CA608865、BJ272559），BJ272559仅在12 h有意义下调表达；BE417035在12 h下调，24～72 h转为上调；CK213813、CA608865在2～6 h上调，12 h转为下调，24～72h上调（图1）。

2.3 MADS-box基因家族中AGL9亚族基因的表达分析

在小麦幼胚脱分化过程中，发现编码调节外界信号反应蛋白AGL9的5个基因（BJ221584、BJ276784、CA726603、CD374109、CN009238，图1）。这5个基因在幼胚脱分化过程中均呈下调表达趋势，其中在2、12 h全部下调。靶基因AG有一个成员（CA658343），仅在12、72 h表达。靶基因fbp2编码果糖-1，6-二磷酸酶（fructose-1，6-bisphosphatase），有两个成员（CD894372、CA686703），其中，CD894372在2～6、24～72 h上调表达，在12 h下调表达，CA686703仅在6～12h下调表达。

2.4 MADS—box基因家族中CO亚族基因的表达分析

CO亚族基因编码开花时间早晚的成花计时相关转录因子，其转录的mRNA达到一定域值时可显著地促进靶基因LFY的表达。本试验编码转录因子CO的有4个基因（BE442521、BG906984、CA670406、CA730918），在小麦幼胚脱分化过程中呈下调趋势，12 h时下调幅度最大，推测这4个基因在12 h抑制作用最强。其中，BG906984在2～72 h均下调。靶基因LFY（CD911368）在12 h下调（图1）。推测在小麦幼胚脱分化过程中，转录因子CO基因对其靶基因LFY（CD911368）可能具有一定的促进作用。

2.5 RT-PCR检测MADS-box基因芯片数据的可靠性

根据小麦基因芯片信号值的高低，抽取CA670406、CK213813、CA608865和AB107992共4个MADS-box基因进行RT-PCR检测（以β-actin内参作为对照），对基因芯片数据可靠性进行验证。经比较可知，小麦基因芯片结果与RT—PCR检测结果基本一致，说明Affymetrix小麦基因芯片数据相对可靠。

3结论与讨论

MADS-box基因的生物学功能非常丰富，但前人研究内容主要侧重于植物生殖生长如花器官发育、种子发育、果实发育等方面，研究对象主要集中于拟南芥、水稻等植物。本试验在对小麦成熟胚脱分化中MADS-box基因的表达进行分析的基础上，对小麦幼胚脱分化中MADS-box基因的表达变化进行研究，证明MADS-box基因不仅在小麦成熟胚脱分化中表达，而且也在小麦幼胚脱分化中表达，拓宽了MADS-box家族基因在小麦中的表达范围。此外，本研究再次证明MADS-box基因在生理学上具有分化、脱分化双重功能。本试验共研究了20个MADS-box基因的表达变化，这些基因整体以下调表达为主，其中下调表达基因共14个，混合表达基因6个，表明小麦幼胚脱分化过程是一个受多个MADS-box基因控制的复杂的调控过程。这些基因大量下调表达，推测它们在幼胚脱分化中抑制作用相对较强。在小麦幼胚脱分化的各个时期，20个MADS-box基因在12 h均下调，其中19个基因的下调值是对照值的15倍，表明12 h是MADS-box基因大量表达的一个关键时期。此外，MADS-box基因在幼胚脱分化中发生上调的有6个，表达强度变化较小，上调值达到对照3.7倍的仅有CD894372、BE417035、CK213813这3个基因，推测这些基因在小麦幼胚脱分化过程中具有一定的促进作用。