花椰菜总黄酮提取工艺优化

尹鹏 郭新 梁梓 胡霞

摘要：【目的】优化花椰菜总黄酮提取工艺，为其药用开发与利用提供技术参考。【方法】以乙醇为浸提溶剂、花椰菜总黄酮含量为考察指标，选择乙醇体积分数、液料比、提取温度、提取时间4个因素进行单因素试验，每个因素各筛选4个水平进行正交试验，以优化花椰菜总黄酮提取工艺。【结果】影响花椰菜总黄酮提取效果的主次因素排序为：乙醇体积分数>提取时间>提取温度>液料比；花椰菜总黄酮最佳提取工艺条件为：乙醇体积分数60%、液料比50∶1、提取温度60 ℃、提取时间2.0 h，此条件下提取获得花椰菜总黄酮含量为0.932 mg/g。【结论】正交试验优选的乙醇浸提工艺操作简便、合理可行，是提取花椰菜总黄酮的有效方法。

关键词： 花椰菜；总黄酮；正交试验；工艺优化

中图分类号： R284.2 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2016）04-0640-05

0 引言

【研究意义】黄酮类化合物具有多种药理作用，可有效清除人体内自由基、改善血液循环、降低胆固醇，已广泛应用于心血管疾病的治疗（尉芹等，2001；刘品华等，2014）。花椰菜（Brassica oleracea L. var. botrytis L.）隶属十字花科（Brassicaceae）芸薹属（Brassica），为一年生植物，富含黄酮。但目前有关其黄酮提取工艺的研究较少，且获得的提取率较低，因此，优化花椰菜总黄酮提取工艺，对其药用开发与利用具有重要意义。【前人研究进展】对于结构和来源不同的黄酮类化合物，一般以其极性和水溶性大小为基础选择合适的溶剂和方法进行提取，主要采用有机溶剂萃取、热水提取、超声波提取、碱性稀醇或碱性水提取、酶解提取、微波辅助萃取等（李睿等，2009；冯宗帅等，2009；杨海荣和田建林，2009；公衍玲等，2010；戴余军等，2010）。长期以来，黄酮提取工艺的研究主要集中在药用植物方面。近年来，蔬菜黄酮的提取逐渐受到重视，如周宝利等（2012）对茄子黄酮提取工艺进行优化，得到最佳提取条件为：乙醇体积分数80%、提取温度40 ℃、提取时间80 min，料液比1∶20，在此条件下提取率为2.2%；陈建福和施伟梅（2014）利用纤维素酶辅助法优化西兰花总黄酮提取工艺，在最佳工艺条件下得到西兰花总黄酮提取率为1.251%，较传统提取方法的提取率提高了41%；张翔宇等（2015）采用超声波协同酶法提取芹菜中总黄酮，提取率为1.0184%。此外，对于南瓜总黄酮的研究相对较系统，南瓜花、苗、瓤、叶、茎中总黄酮提取条件的优化均有相关报道（王小华等，2008；张欣和曾光银，2010；周志娥等，2011；李南薇等，2011）；也有丝瓜叶（杜敏华和张彩莹，2007）、大白菜球叶（李娟等，2007）、马铃薯皮（王利珍等，2011）、辣椒叶（王艳丽等，2013）总黄酮提取方面的报道。【本研究切入点】目前，有关花椰菜总黄酮提取工艺方面的研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】选择乙醇体积分数、液料比、提取温度、提取时间为考察因素，以总黄酮含量为评价指标，在单因素试验的基础上，通过正交试验优化花椰菜总黄酮提取工艺，为花椰菜药用开发与利用提供技术参考。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

花椰菜（金田1号，成都金田种业有限责任公司）鲜品洗净后烘干，捣碎，过50目筛备用。芦丁标准品、氢氧化钠、亚硝酸钠、硝酸铝、无水乙醇等试剂均为国产分析纯，购自合肥博美生物科技有限责任公司。主要仪器设备：BS224S电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）、GZX-GF-101-2-Ⅱ电热恒温鼓风干燥箱（上海贺德实验设备有限公司）、SHA-B水浴恒温振荡器（金坛市仪器厂）、A-88组织捣碎机（金坛市仪器厂）、TDZ5-WS多管架自动平衡离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）、JY92-Ⅱ超声波细胞粉碎机（宁波新芝生物科技股份有限公司）、T6新悦可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）。

1. 2 标准曲线绘制

参照梁梓等（2012）、尹鹏等（2015）的方法，以总黄酮质量浓度为横坐标、吸光值为纵坐标绘制标准曲线。

1. 3 花椰菜总黄酮含量测定

称取花椰菜样品，在不同乙醇体积分数、液料比、提取温度、提取时间下浸提总黄酮，并根据标准曲线计算花椰菜总黄酮含量（梁梓等，2012；尹鹏等，2015）。

1. 4 单因素试验

1. 4. 1 乙醇体积分数对花椰菜总黄酮的提取效果 称取6份1.0 g花椰菜样品，分别加入40 mL 40%、50%、60%、70%、80%和90%乙醇，于50 ℃水浴加热1.5 h后，4000 r/min离心15 min，取上清液测吸光值。

1. 4. 2 液料比对花椰菜总黄酮的提取效果 称取6份1.0 g花椰菜样品，按液料比30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1和80∶1分别加入50%乙醇，于50 ℃水浴加热1.5 h后，4000 r/min离心15 min，取上清液测吸光值。

1. 4. 3 提取温度对花椰菜总黄酮的提取效果 称取6份1.0 g花椰菜样品，加入40 mL 50%乙醇，分別于30、40、50、60、70和80 ℃水浴加热1.5 h，4000 r/min离心15 min后，取上清液测吸光值。

1. 4. 4 提取时间对花椰菜总黄酮的提取效果 称取6份1.0 g花椰菜样品，加入40 mL 50%乙醇，于50 ℃水浴分别加热0.5、1.0、1.5、2.0、2.5和3.0 h，取出后4000 r/min离心15 min，取上清液测吸光值。

1. 5 正交试验优化提取工艺

根据单因素试验结果，选取对花椰菜总黄酮含量提取有意义的因素水平进行正交试验，采用L16（45）正交试验优化提取工艺条件（宋利华等，2012）。因素水平见表1。

1. 6 工艺验证试验

根据正交试验结果优选出的提取工艺条件进行验证试验，3次平行试验，测定花椰菜总黄酮含量。

1. 7 统计分析

分别采用Office 2007和SPSS 13.0软件对试验数据进行处理和方差分析。

2 结果与分析

2. 1 芦丁标准曲线

芦丁标准曲线如图1所示，回归方程为：y=16.504x+0.0063（R2=0.9994），总黄酮质量浓度在0～0.06 mg/mL范围内与吸光值呈良好的线性关系。

2. 2 单因素试验结果

2. 2. 1 乙醇体积分数对花椰菜总黄酮提取效果的影响 由图2可知，随着乙醇体积分数的增大，花椰菜总黄酮含量缓慢增加，但超过80%后，总黄酮含量反而降低；乙醇体积分数为80%时，花椰菜总黄酮含量显著高于其他水平（P<0.05，下同）。因此，选择60%、70%、80%和90% 4个水平进行正交试验。

2. 2. 2 液料比对花椰菜总黄酮提取效果的影响 由图3可知，随着液料比的增加，花椰菜总黄酮含量不断增加，液料比超过40∶1后，随着液料比的继续增加，总黄酮含量却不断降低，最后逐渐趋于稳定状态；液料比为40∶1时，花椰菜总黄酮含量显著高于除50∶1之外的其他4个水平。因此，选择30∶1、40∶1、50∶1和60∶1 4个水平进行正交试验。

2. 2. 3 提取温度对花椰菜总黄酮提取效果的影响 由图4可知，随着提取温度的升高，花椰菜总黄酮含量逐渐增加，当提取温度为50 ℃时，总黄酮含量最高，显著高于30、70和80 ℃时的总黄酮含量。故选择30、40、50和60 ℃ 4个水平进行正交试验。

2. 2. 4 提取时间对花椰菜总黄酮提取效果的影响 由图5可知，随着提取时间的延长，花椰菜总黄酮含量不断增加，超过1.5 h后，随着提取时间的继续延长，总黄酮含量反而逐渐降低；提取1.5 h所得的花椰菜总黄酮含量显著高于0.5和3.0 h的总黄酮含量。因此，选择1.0、1.5、2.0和2.5 h 4个水平进行正交试验。

2. 3 正交试验结果

由表2可知，影响花椰菜总黄酮含量的各因素主次排序为：A>D>C>B，即乙醇体积分数是影响花椰菜总黄酮提取效果的主要因素，其次为提取时间和提取温度，而液料比的影响相对较小。根据极差分析得到花椰菜总黄酮提取的最佳工艺组合为A1B3C4D3，即乙醇体积分数60%、液料比50∶1、提取温度60 ℃、提取时间2.0 h；根据直观分析得到花椰菜总黄酮提取的最佳工艺组合为A1B3C3D3，即乙醇体积分数为60%、液料比为50∶1、提取温度为50 ℃、提取时间为2.0 h时，花椰菜总黄酮含量最高，为0.919 mg/g。因极差分析结果与直观分析结果不同，故需通过验证试验确定最佳提取工艺条件。

2. 4 验证试验结果

按照极差分析优选出的工艺条件进行验证试验，重复测定3次，花椰菜总黄酮平均含量为0.932 mg/g，RSD为1.56%，总黄酮含量高于正交试验中任何一组数据，说明利用正交试验的极差分析优选出的提取工艺合理可行。

3 讨论

本研究在单因素试验的基础上，选择乙醇体积分数、提取温度、提取时间、液料比4因素的4个水平进行正交试验，以优化花椰菜总黄酮提取工艺，结果表明，乙醇体积分数是影响花椰菜总黄酮提取效果的主要因素，其次是提取时间和提取温度，而液料比影响相对较小，与杜敏华和张彩莹（2007）的研究结果一致。在单因素试验中，发现乙醇体积分数为80%时，花椰菜总黄酮含量最高，之后随着乙醇体积分数的继续增大，总黄酮含量反而下降，其原因可能是当乙醇体积分数增至一定值，溶液极性显著增强，溶液中一些溶于乙醇的杂质溶出，与黄酮类物质竞争同乙醇—水分子的结合，从而致使总黄酮溶解度降低（陈婵等，2015）。今后可在乙醇体积分数方面进行深入探究，以期找出更佳的试验水平。

本研究通过正交试验优化得到花椰菜总黄酮提取工艺条件为：乙醇体积分数60%、液料比50∶1、提取温度60 ℃、提取时间2.0 h，在此条件下得到花椰菜总黄酮含量为0.932 mg/g；而周向军等（2010）利用响应面法对西兰花总黄酮提取工艺进行优化，得到最佳工艺条件为：乙醇体积分数90%、液固比30∶1、提取温度85 ℃、提取时间1.82 h，得率为0.853%。对比可知，本研究的提取工艺条件相对较温和，提取率也较高，可有效提取花椰菜总黄酮。

4 结论

正交试验优选的乙醇浸提工艺操作简便、合理可行，是提取花椰菜总黄酮的有效方法。

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（责任编辑 罗 丽）