从江香猪CYP2A19基因单核苷酸多态性的群体遗传学分析

杨家大 任琼 吴声榕

摘要：【目的】评估从江香猪CYP2A19基因的纯合度及遗传变异，为开发从江香猪药物代谢模型積累基础资料。【方法】应用SNaPshot检测方法对141份从江香猪样本CYP2A19基因编码区rs323914689、rs81217981、rs333289891、rs343272409位点及3'端非翻译区rs338584662和rs321736682位点进行分型分析，并计算从江香猪种群的基因型频率、等位基因频率、有效等位基因数（Ne）、杂合度（He）、多态位点数及多态位点百分比。【结果】除rs333289891位点表现为单态外，其余5个位点均检测到2种或3种基因型，多态位点百分比为83.33%。χ2检验结果显示，5个多态位点均处于Hardy-Weinberg平衡状态（P>0.05）。5个多态位点的Ne介于1.0071～1.3129，He介于0.0071～0.2057。【结论】不同品系猪种由于遗传背景差异而具有不同的单核苷酸变异，其药物代谢特性也因此存在差异。从江香猪群体纯合度高、遗传稳定性好、变异程度低，是其作为药物代谢动物模型的关键基础。

关键词： 从江香猪；CYP2A19基因；多态位点；遗传学分析

中图分类号： S828.89 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2016）07-1209-07

0 引言

【研究意义】从江香猪产于贵州省从江县，是我国稀有的优良地方微型猪种，其个体矮小，早熟易肥，肉肥而不腻，经白水煮熟后味香、汤清甜、肉质细嫩，是制作高档肉制品的理想材料。同时，因其体型矮小，解剖学特性、生理学生化学指标与人类相似，基因纯合，近交不退化，是较理想的实验动物模型（杨秀江，2002），在药物评价中具有广阔的应用前景。细胞色素氧化酶P450（Cytochrome P450 enzymes，CYP）是一类含亚铁血红素的超基因家族酶系，参与机体内生物转化的I相代谢反应，通过氧化方式可将水溶性差的内、外源性物质转变为水溶性强的物质，而进入II相代谢反应，在药物及异源物质的代谢过程中发挥重要作用（张慧锋等，2005；华梓婷等，2007；商海涛等，2008）。因此，研究从江香猪细胞色素氧化酶的基因纯合度及催化特性，对评估其在药物代谢动物模型中应用的可能性具有重要意义。【前人研究进展】在人体中，CYP1、CYP2、CYP3这3个家族参与了95%的外源物代谢活动（赵春等，2014）。CYP2A6是CYP2A亚家族的主要酶，存在于成人的肝脏中，其含量占人体CYP总蛋白的4%（张小梅等，2011），代谢的药物占人体CYP代谢药物总量的3%（于敏等，2013），特征性反应为香豆素-7'-羟基化反应。CYP2A6还参与黄曲霉素B1、亚硝胺盐、环境化合物汽油醚及烟草中尼古丁等结构非相关前致癌物的激活（蒋卉和陈一岳，2007）。在猪体内，早在1985年Kaipainen等就检测到高水平的香豆素-7'-羟基化酶活性。1999年，Skaanild和Friis发现G ttingen小型猪CYP2A活性与Western blotting的蛋白水平相关，且mRNA水平与CYP2A活性呈弱相关，据此推测小型猪CYP2A表达受转录水平的调控。此后，Soucek等（2001）对布尔诺白品种G ttingen小型猪肝脏微粒体的研究表明，G ttingen小型猪具有与人体CYP2A6类似的香豆素-7'-羥基化酶活性，以抗人类CYP2A6抗体进行免疫杂交可得到相应的条带，且测序发现小型猪肝脏CYP2A蛋白N-末端前20个氨基酸与人类CYP2A6的相似度达70%，即小型猪CYP2A具有与人体CYP2A类似的特性。李健等（2006）研究表明，贵州小型香猪肝脏微粒体虽然具有香豆素-7'-羟基化反应（CYP2A）活性，但其活性与人体相应反应的活性存在显著差异。人体CYP2A选择性抑制剂——甲氧补骨脂素在低浓度（2.5 μmol/L）下能抑制90%的巴马香猪香豆素-7'-羟基化反应活性（Li et al.，2006）。此外，有研究资料表明，猪体内存在人体CYP2A6的同源酶（Zamaratskaia et al.，2009；Liu et al.，2011；Rasmussen et al.，2011；Brunius et al.，2012），且根据NCBI数据库及有关文献（Matal et al.，2009a，2009b；杨家大等，2011）判定，该酶为CYP2A19。【本研究切入点】P450基因多态性是造成不同个体药物代谢差异的重要基础（张慧锋等，2005），也是制定个体化用药方案的重要理论依据（王一珂等，2016），但至今未见有关从江香猪CYP2A19基因多态性的研究报道。【拟解决的关键问题】应用基于单碱基延伸的SNaPshot检测方法分析从江香猪CYP2A19基因单核苷酸多态性，评估其基因纯合度及遗传变异，为开发从江香猪药物代谢模型积累基础资料。

1 材料与方法

1. 1 从江香猪来源

141头健康从江香猪分别来自贵州省从江县宰便、加鸠、加勉、光辉、加榜、刚边等乡（镇），年龄2～3月龄，体重8～11 kg，性别及阉割状况不限。屠宰后立即剪下一小块肝脏组织，经生理盐水冲洗血污后置于液氮中冻存备用。

1. 2 引物设计与合成

根据各SNP位点上、下游250 bp以内的DNA序列，应用Primer Premier 5.0设计PCR引物及延伸反应引物（表1），由上海捷瑞生物工程有限公司合成。其中，rs343272409位点检测的是互补链碱基类型。

1. 3 肝脏DNA提取

取5～20 mg肝脏组织样品，加液氮研磨成粉末，然后按照离心柱型细胞/组织基因组DNA提取试剂盒（上海捷瑞生物工程有限公司，GK0122）说明进行提取，稀释至5～10 ng/μL用于PCR。

1. 4 多重PCR及扩增产物纯化

反应体系为15.00 μL，包括10×Buffer 1.50 μL，25 mmol/L MgCl2 1.50 μL，10 mmol/L dNTP 0.30 μL，10 μmol/L引物各0.15 μL，基因组DNA 1.0 μL，5 U/μL Taq DNA聚合酶0.30 μL，ddH2O补足至15.00 μL。扩增程序：94 ℃预变性3 min；94 ℃ 15 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，进行35个循环；72 ℃延伸3 min。扩增产物经2.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定后进行多重PCR。rs323914689、rs81217981、rs333289891和rs343272409位点在一个反应体系中扩增，rs338584662和rs321736682位点在另一个反应体系中扩增。

纯化体系7.0 μL，其中扩增产物3.0 μL、20 U/μL Exonuclease I（Thermo Scientific公司）0.2 μL、1 U/μL FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase（Thermo Scientific公司）0.8 μL、10×Buffer 0.7 μL。纯化程序：37 ℃反应15 min，然后80 ℃灭活15 min。

1. 5 多重延伸反应及延伸产物纯化

延伸反应体系6.0 μL，包括纯化PCR产物2.0 μL、含不同荧光标记ddNTP的SNaPshot Multiplex Ready Reaction Mix（Applied Biosystems公司）1.0 μL、10 μmol/L延伸引物各0.2 μL。反应程序：96 ℃预变性1 min；96 ℃ 10 s，52 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，进行30个循环；然后向反应产物中加入FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase（Thermo Scientific公司）0.2 μL，37 ℃处理15 min，再80 ℃灭活15 min。

1. 6 毛细管电泳及基因型判读

取1.0 μL纯化延伸产物，加9.0 μL上样Formamide deionized（Amresco公司），95 ℃变性3 min后立即冰水浴5 min，在ABI 3730XL型DNA序列检测仪（Applied Biosystems公司）上进行毛细管电泳约1 h。然后以Peak ScannerTM Software v1.0（Applied Biosystems公司）打开毛细管电泳生成后缀为fsa的文件，再根据延伸产物片段大小、峰图颜色、突变位置的核苷酸种类等综合判定各SNP位点在图谱中的位置及基因型。峰图中红、黑、蓝、绿波峰分别代表胸腺嘧啶脱氧核苷酸（T）、胞嘧啶脫氧核苷酸（C）、鸟嘌呤核糖核苷酸（G）和腺嘌呤核糖核苷酸（A）；只有一个峰为纯合子，出现2个或2个以上峰则为杂合子。

1. 7 统计分析

采用基因计数法计算种群的基因型频率，PopGen 32统计等位基因频率、Hardy-Heinberg平衡的χ2和P、有效等位基因数（Ne）、杂合度（He）、多态位点数及多态位点百分比。

2 结果与分析

2. 1 PCR扩增结果

经2.5%琼脂糖凝胶电泳检测，发现rs333289891、rs323914689、rs343272409、rs321736682、rs81217981和rs338584662位点的PCR产物片段大小均与预期结果一致，且无非特异性扩增条带（图1），说明PCR产物可用作下一步延伸反应的模板。

2. 2 SNP位点的分型峰图

141份从江香猪样品CYP2A19基因rs333289891、rs323914689、rs343272409、rs321736682、rs81217981和rs338584662位点的延伸反应产物纯化后经ABI 3730XL型DNA序列检测仪毛细管电泳，并由Peak ScannerTM Software v1.0读取后，得到各位点的分型图谱。其中，rs333289891位点仅检测到1种峰型，对应的基因型为CC（图2）；rs323914689位点检测到2种峰型，对应的基因型分别为CC（图3-A）和CG（图3-B）；rs343272409位点检测到2种峰型，对应的基因型分别为AA（图4-A）和AC（图4-B）；rs321736682位点检测到2种峰型，对应的基因型分别为CC（图5-A）和CT（图5-B）；rs81217981位点检测到3种峰型，对应的基因型分别为AA（图6-A）、AG（图6-B）和GG（图6-C）；rs338584662位点检测到3种峰型，对应的基因型分别为CC（图7-A）、CG（图7-B）和GG（图7-C）。

2. 3 群体遗传学统计结果

在6个SNP位点中，除rs333289891位点表现为单态外，其余5个位点均检测到2种或3种基因型，多态位点百分比为83.33%。其中，rs323914689位点的优势基因型为CC，共138份，基因型频率为0.9787；rs343272409位点的优势基因型为AA，共140份，基因型频率为0.9929；rs321736682位点的优势基因型为CC，共140份，基因型频率为0.9929；rs81217981位点的优势基因型为GG，共107份，基因型频率为0.7589；rs338584662位點的优势基因型为GG，共108份，基因型频率为0.7660。χ2检验结果显示，5个多态位点均处于Hardy- Weinberg平衡状态（P>0.05）。5个多态位点的Ne介于1.0071～1.3129，He介于0.0071～0.2057。各位点的基因型频率、等位基因频率、Ne、He等群体遗传学指标统计结果见表2。

3 讨论

CYP多态性包括酶（表型）多态性和基因多态性。其中，表型多态性可将个体按代谢速度分为强代谢型、弱代谢型、中等代谢型和超强代谢型（于敏等，2013）；而基因多态性是导致个体差异明显表型多态性的原因（华梓婷等，2007）。根据UCSC Genome Browser和NCBI数据库信息可知，猪CYP2A19基因登录号为NM_214417，其DNA序列全长为5387 bp，包含5个外显子，共有33个已知SNP位点，其中4个位于编码区，2个位于3'端非翻译区，其余均位于内含子中。在这2个数据库中，并未登记有CYP2A19基因SNP位点的等位基因频率，也未见有关这些等位基因频率的文献报道。本研究应用基于單碱基延伸的SNaPshot检测方法，参考猪CYP2A19基因编码区及3'端非翻译区已知的6个SNP位点信息，对从江香猪进行群体遗传学分析，结果表明，rs333289891位点表现为单态，而数据库登记该位点为多态位点。由于rs333289891位点突变属于错义突变，对应的氨基酸改变为346R→W，即由精氨酸突变为色氨酸，二者的分子大小、极性及电荷性均不一样。因此，若排除检测样本数量的原因，可推测从江香猪CYP2A19基因rs333289891位点具有不同于其他猪种（或品系）的核苷酸，核苷酸组成不同可能导致对CYP2A19底物代谢能力不同，因此从江香猪与其他猪种间的药物代谢数据不能共享。商海涛等（2008）对原始种群来源于从江香猪的贵州小型猪CYP3A29编码区基因序列进行克隆测序及比对分析，发现贵州小型猪CYP3A29编码区存在CYP3A29*1C和CYP3A29*1D共2个SNP位点及1个缺失89 bp并产生移码的可变剪接。与巴马香猪及日本学者提交NCBI的AB052260序列相比，CYP3A29*1C位点仅存在于贵州小型猪，在巴马香猪及AB052260序列中均不存在。据此推测，猪CYP3A29编码区的单核苷酸变异与其遗传背景相关，不同品系猪种由于遗传背景差异而具有不同的单核苷酸变异，不同品系间的药物代谢特性也因此存在差异，作为药物代谢模型予以研究时就必须考虑序列变异引起的品系代谢特性差异。

从江香猪CYP2A19基因rs323914689、rs343272409、rs321736682、rs81217981和rs338584662位点虽然均具有多态性，但杂合子频率非常低，rs323914689、rs343272409 和rs321736682位点均未发现突变型纯合子，各多态位点优势基因型的频率非常高，2种等位基因的基因频率差异明显，说明从江香猪CYP2A19基因纯合度高，即验证了其基因纯合的优良特性。5个多态位点的Ne与等位基因实际观察值间的差值较明显，表明等位基因在群体中分布不均匀、变异小。此外，从江香猪群体He均低于0.2500，也表明其遗传变异程度低，遗傳稳定性好。在从江香猪产区多行自繁自养制度，由于长期高度近亲繁殖最终形成了高度纯合、近亲交配不退化、不变异及性成熟早的优良品质（申学林，2005），而这些特性恰好奠定了从江香猪作为药物代谢动物模型的关键基础。

4 结论

不同品系猪种由于遗传背景差异而具有不同的单核苷酸变异，其药物代谢特性也因此存在差异。从江香猪群体纯合度高、遗传稳定性好、变异程度低，是其作为药物代谢动物模型的关键基础。

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（責任編辑 兰宗宝）