百毒杀及来苏儿对金黄色葡萄球菌的杀菌效果比较试验



百毒杀及来苏儿对金黄色葡萄球菌的杀菌效果比较试验

生产中常用的消毒剂有百毒杀和来苏儿，百毒杀是一种双链季胺高效表面活性消毒剂，具有无色、无味、无毒和无腐蚀性，并能与水互溶特点。百毒杀是目前世界上最优秀的双链季胺盐消毒剂之一。来苏儿消毒剂属酚类消毒剂，是甲酚阴离子表面活性剂、两性表面活性剂等辅助成分组成的无色透明液体。我们通过试验，对百毒杀和来苏儿两种消毒剂对金黄色葡萄球菌的杀灭效果进行比较。

1　材料与方法

1.1试验材料

1.1.1病料。本试验采用某一死亡家禽的肺部作为病料，4℃冰箱保存备用。

1.1.2消毒剂。百毒杀和来苏儿由天津市动物疫病预防控制中心提供。

1.1.3培养基。血平板培养基、营养琼脂培养基。

1.1.4设备仪器。电子天平、药匙、锥形瓶、玻璃棒、电炉、高压灭菌锅、超净工作台、恒温恒湿培养箱、冰箱、平皿、试管、试管架、剪刀、移液器、接种环、载玻片、量筒，由天津农学院预防兽医学实验室提供。

1.1.5药物和试剂。百毒杀、来苏儿、营养琼脂、氯化钠、蛋白胨、牛肉膏、蒸馏水、革兰氏染液、兔血琼脂培养基、吐温-80（1%）。

1.2试验方法。试验操作前，先将试验所需的器材用报纸包裹好放置高压灭菌锅灭菌20m in，再放入无菌操作台紫外线灭菌，然后继续试验。

1.2.1培养基的配制。固体培养基：用电子天平称取42 g营养琼脂放入锥形瓶，加入1 000m l蒸馏水放置电炉加热煮沸溶解。液体培养基：用电子天平称取牛肉膏1.0 g，蛋白胨2.0 g，氯化钠1.0 g，蒸馏水200m l，放置锥形瓶中用电炉加热煮沸溶解。以上两种溶液配制好后用瓶塞盖好放置高压灭菌锅中灭菌20min，取出放入超净工作台倒板，固体培养基倒入平皿内，每板1/3，液体培养基倒入灭菌的试管，待恢复室温待用。

1.2.2细菌的分离培养与鉴定。①细菌的分离培养。在超净工作台中操作，用酒精棉擦拭病料表面，取一小块组织，使新鲜切面平整，直接接种到兔血琼脂培养基上，将培养基放入在37℃恒温培养箱中培养20～24 h。取出并观察细菌的菌落形态、生长情况和溶血现象。放置在4℃冰箱中备用。②细菌的纯化。用灭菌的接种环在经过24 h培养的血琼脂培养基上挑取生长菌落较小、较湿、较透明、边缘整齐、隆起的单一的菌落，划线接种到血琼脂培养基上，倒置在37℃的恒温培养基中进行纯化培养，培养24 h。取出培养基观察菌落特征，放置4℃冰箱中备用。③菌悬液的制备。将分离出的单个菌落接种到提前制备的普通液体培养基中，放到37℃恒温培养箱中培养24 h，观察培养基的浑浊度，根据其浑浊度再培养12 h，制备成均匀的菌悬液。然后，拿出培养基置于4℃冰箱，备用。④镜检。用灭菌接种环从摇匀的液体培养基中取一环的菌液，在玻璃片的中间位置均匀地涂抹成适当大小的薄层。待自然干燥后将其固定，然后做革兰氏染色，革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤，在显微镜观察细菌的形态。染色结果：革兰氏阳性菌都呈紫色，革兰氏阴性菌都呈红色。

1.2.3生化试验。将待检的菌株分别接种到葡萄糖、麦芽糖、乳糖、过氧化氢酶、甘醇、蔗糖培养基中，开口朝下，置灭菌培养皿中。37℃培养24 h，观察并记录结果。

1.2.4细菌消毒试验。①菌落计数试验。将菌悬液取出1m l，放入试管中，用经过高压灭菌的蒸馏水稀释为10-1，，以此类推，直到稀释到10-5，用经过高压灭菌的棉签，在菌悬液中蘸取少许10-4与10-5两种不同浓度的菌悬液，均匀的涂抹在培养24 h的普通琼脂培养基上，培养24 h，数出单个菌落个数（30～300之间有效），乘以稀释度，即为菌悬液中细菌的个数。②抑菌试验。采用杯碟法，在超净工作台上，将半固体培养基倒在固体培养基表面，凝固后再轻轻的用镊子将五个无菌牛津杯放在半固体培养基表面，要求分散且等距。在牛津杯中分别加入不同浓度梯度（1%、0.5%、0.25%、0.13%、0.07%）但等量（50μl）的消毒剂，做好标记。放入37℃恒温箱中培养24 h，取出，观察比较抑菌圈大小，测出并记录各抑菌圈的直径。③悬液定量杀灭试验。将制成的菌悬液用移液器取50μl于EP管中（5个），分别加入450μl不同浓度的消毒剂，混匀，做好标记。作用5～20 m in后，从中分别取出100μl于另五个EP管中，分别加入900μl中和剂吐温-80，作用一段时间后，取出50μl并加入450μl的蒸馏水，之后进行倍比稀释。置于37℃恒温培养箱中培养24 h。倍比稀释后，取合适的稀释液进行涂板计数，每个稀释液对应两个平板。计数时，首先选平均菌落数在30～300之间的，若在此区间之外的菌落数不予采用。

细菌杀灭率=（消毒前菌数—消毒后菌数）/消毒前菌数

2　试验结果

2.1菌落形态。在血平板培养基上培养的金黄色葡萄球菌呈金黄色，也有时为白色，大而突起，圆形，不透明，表面光滑，周围有溶血圈。在普通培养基上培养的金黄色葡萄球菌生长良好。37℃、24 h，白色，光滑，不透明，半径1～2mm。

2.2细菌形态学检查。用灭菌接种环从摇匀的液体培养基中取一环的菌液，在玻璃片的中间位置均匀地涂抹成适当大小的薄层。待自然干燥后将其固定，然后做革兰氏染色。被检细菌菌体呈紫色球形，革兰氏阳性菌落。

2.3生化试验结果。将待检的菌株分别接种到葡萄糖、麦芽糖、乳糖、过氧化氢酶、甘醇、蔗糖培养基中，开口朝下，置灭菌培养皿中。37℃培养24 h，观察并记录结果。

表1　生化试验结果

2.4细菌抑制试验。将半固体培养基倒在固体培养基表面，凝固后再轻轻的用镊子将五个无菌牛津杯放在半固体培养基表面，要求分散且等距。在牛津杯中分别加入不同浓度梯度（1%、0.5%、0.25%、0.13%、0.07%）但等量（50μl）的消毒剂，做好标记。放入37℃恒温箱中培养24 h，取出，观察比较抑菌圈大小，测出并记录各抑菌圈的直径，百毒杀抑菌效果相对来苏儿效果较好，百毒杀的抑菌圈由1 cm逐渐减小到0.2 cm，而来苏儿只有1%是有效果，且效果不太明显，抑菌圈直径仅为0.1 cm。

本试验中，两种消毒剂的抑菌效果是通过它的抑菌圈、杀菌率来体现的。

表2　两种消毒剂不同浓度抑菌圈（直径）大小　（cm）

表3　消毒剂对金黄色葡萄球菌的杀菌率

3　结论

试验结果表明，在一定浓度下，2种消毒剂对金黄色葡萄球菌均有不同程度的作用。但不同的消毒剂杀菌效果不一样。在一定浓度下，2种消毒剂的杀菌率随着消毒时间与浓度的增大而增强。其中，百毒杀的效果优于来苏儿的杀菌效果。来苏儿溶液杀菌效果作用较弱，在稀释到1%时效果不太明显，而且要达到100%灭菌效果需要的时间比其他的消毒剂要长。

301600天津市静海区畜牧水产业发展服务中心张培培