STR基因座与Amelogenin的峰面积比在DNA降解评估中的应用

解雅玲，李　璐，邵诚臣，吴轶慧，杜铁帅，周怀谷，李　辉，谢建辉，沈忆文（.复旦大学基础医学院法医系，上海000；.上海市公安局静安分局，上海00040；.上海市公安局物证鉴定中心法医物证学现场应用技术公安部重点实验室上海市现场物证重点实验室，上海0008）



STR基因座与Amelogenin的峰面积比在DNA降解评估中的应用

解雅玲1，李璐2，邵诚臣1，吴轶慧1，杜铁帅1，周怀谷3，李辉3，谢建辉1，沈忆文1
（1.复旦大学基础医学院法医系，上海200032；2.上海市公安局静安分局，上海200040；3.上海市公安局物证鉴定中心法医物证学现场应用技术公安部重点实验室上海市现场物证重点实验室，上海200083）

摘要：目的研究DNA降解过程中STR基因座与性别基因座Amelogenin（AMEL）峰面积比（STR/AMEL）的变化规律，探讨STR/AMEL值在评估DNA降解程度中的应用。方法取人体髂腰肌组织抽提DNA，分析DNaseⅠ酶人工降解后STR/AMEL值（Penta E/AMEL、Penta D/AMEL、FGA/AMEL）的变化，并分析室外环境自然降解的髂腰肌组织中三者比值的变化。以降解时间为自变量（x），STR/AMEL值为因变量（y），进行回归曲线分析，建立两种条件下三组曲线方程。结果人工降解及自然降解条件下STR/AMEL值与降解时间均呈负相关，一元三次方程能够较好地模拟STR/AMEL值随降解时间的变化规律。人工降解条件下，R2均大于0.99；自然降解条件下，R2均大于0.86。结论STR/AMEL值（Penta E/AMEL、Penta D/AMEL、FGA/AMEL）与DNA降解程度呈负相关，有望应用于DNA降解程度的评估。

关键词：法医遗传学；DNA降解，坏死；短串联重复序列；峰面积

从理论上来说，DNA离体时间越长或机体死后时间越长，DNA片段的降解程度就越高。相比短的DNA片段，长片段拥有更多的磷脂键，被外界因素破坏的机会更大。因此，检测短片段DNA和长片段DNA的相对含量是评估DNA降解程度的重要手段。对DNA降解程度进行分析，目前主要有定量PCR （q－PCR）法、定量模板扩增技术（quantitative template amplification technology，Q－TAT）［2－4］等。q－PCR法是扩增两个片段大小不同的DNA片段，通过小片段与大片段含量比值的变化反映DNA降解程度，能够动态反映目的片段的变化。Q－TAT法为PCR后定量的方法，对扩增产物进行毛细管电泳，分离不同片段，利用荧光强度（用峰面积或者峰高表示）表示各位点含量。q－PCR法和Q－TAT法均通过基因组DNA进行非个人识别的额外检测，需要消耗部分生物检材，同时增加了办案人员的工作量和工作时间。

在STR分型中，Amelogenin－X和Amelogenin－Y的长度约100bp，属于短片段DNA，片段长度在个体中是恒定的。对于体外提取的非降解DNA来说，不考虑小等位基因的优势扩增，Penta E、Penta D、FGA与Amelogenin（AMEL）扩增后产物含量的比值为1。随着DNA降解程度的增加，Penta E/AMEL、Penta D/AMEL、FGA/AMEL值理论上应该逐渐降低。因此，在进行个人识别的同时，通过STR峰面积与AMEL峰面积比（STR/AMEL）分析DNA降解程度，不仅能够从基因组DNA中获得更多的信息，也减少了办案人员的工作量，缩短了工作时间。

本研究应用与Q－TAT类似的方法，选择了Power-Plex®21系统中片段最短的性别基因座AMEL和片段最长的Penta E、Penta D、FGA作为研究对象，应用PowerPlex®21系统试剂盒检测相应基因座的荧光面积，计算STR/AMEL值，探讨其与降解程度的关系。

1　材料与方法

1.1仪器与试剂

9700型PCR扩增仪、7500型实时荧光定量PCR仪、3130xl型遗传分析仪（美国AB公司），NanoDrop 1000分光光度计（美国Thermo公司）；脱氧核糖核酸酶Ⅰ（DNaseⅠ，美国SIGMA公司），Chelex－100、Power-Plex®21系统（美国Promega公司）。

1.2样本

本研究的髂腰肌组织来源于复旦大学红十字会遗体捐赠中心提供的男性尸体1具，死后当天取材。

“互联网+”也对传统会计行业提出了新的职能要求。事实上，现在的许多会计从业人员还没有意识到本身的工作职能已发生变化。互联网改变了社会各个领域的思维导向和各个企业的经营模式，为传统的会计行业提供了新的发展方向。面对瞬息万变的经济环境，信息和数据以传统的方式已不足以去整理，企业需要从互联网的背景考虑，调整工作人员的工作方向，利用新型的高科技技术来处理信息。

1.3人工降解样本处理

酚－氯仿法提取新鲜髂腰肌组织DNA，用NanoDrop 1000分光光度计测量浓度，定量至（340±10）ng/μL。抽出10μL置于PCR管中，不作任何处理，作为未降解DNA对照（0min）。

在PCR管中加入50μL上述提取的（340±10）ng/μL DNA溶液，加入0.1U DNaseⅠ，混匀，于消化0.5、1、2、3、5min后分别抽取10μL，加入Stop Buffer使其终止反应，70℃10min使DNaseⅠ不可逆失活。采用琼脂糖凝胶电泳检验DNA降解程度。

同样方法，重复提取6次。

1.4自然降解样本处理

取髂腰肌组织约3mm×3mm×3mm置于微量离心管中，共60管，分为10组，每组6管。取1组作为第0天样本，其余放于密封盒中置于室外，记录每天最高气温（中午12：00）与最低气温（晚上21：00），此后每24h取1组置于－80℃保存备用。

应用Chelex－100法提取DNA。在每管中加入5%Chelex－100 200μL，37℃温水浴3 h，95℃金属浴5min。

1.5扩增产物分析

应用PowerPlex®21系统试剂盒进行扩增，按照说明书配制反应体系。扩增条件：96℃1min；94℃10 s，59℃1min，72℃30 s，30个循环；60℃20min。4℃保存。扩增产物应用3130xl型遗传分析仪进行STR分型。

1.6电泳检测和数据分析

使用GeneMapper ID v3.2软件分析数据，峰检测阈值为150 RFU，计算扩增产物峰面积，并计算Penta E/AMEL、Penta D/AMEL、FGA/AMEL值，以降解时间为自变量（x），STR/AMEL值为因变量（y），进行回归曲线分析。

2　结　果

2.1人工降解DNA的评估

琼脂糖电泳检验结果显示，随着DNaseⅠ酶作用时间延长，DNA降解程度增加，片段长度逐渐减小（图1）。该结果也表明基因组DNA在人工降解过程中，其降解程度是可控的，DNaseⅠ酶能够逐渐消化基因组DNA。

图1　DNA人工降解后琼脂糖电泳结果

Penta E、Penta D、FGA与AMEL基因座的峰面积比值见表1。

表1　DNaseⅠ酶处理不同时间后Penta E、Penta D、FGA与AMEL峰面积比值（n=6，±s）

表1　DNaseⅠ酶处理不同时间后Penta E、Penta D、FGA与AMEL峰面积比值（n=6，±s）

时间/min Penta E/AMEL Penta D/AMEL FGA/AMEL 0　0.973±0.075　0.381±0.044　2.161±0.372 0.5　0.748±0.080　0.265±0.038　1.698±0.321 1　0.409±0.092　0.149±0.025　1.291±0.298 2　0.104±0.021　0.047±0.009　0.742±0.256 3　0.041±0.009　0.017±0.004　0.395±0.125 5　0.013±0.006　0.000±0.000　0.184±0.039

随着人工降解时间的延长，各基因座与AMEL的峰面积比值呈下降趋势。建立STR/AMEL值随DNaseⅠ酶处理时间变化的一元三次方程数学模型。

2.2自然降解DNA的评估

Penta E、Penta D、FGA与AMEL基因座的峰面积比值见表2。

表2　死后不同时间Penta E、Penta D、FGA与AMEL的峰面积比值（n=6，±s）

表2　死后不同时间Penta E、Penta D、FGA与AMEL的峰面积比值（n=6，±s）

注：死亡8 d后，Penta E、Penta D、FGA基因座均出现等位基因丢失，故将其值记为0

时间/d Penta E/AMEL Penta D/AMEL FGA/AMEL 0　0.880±0.190　0.513±0.362　2.324±0.546 1　0.573±0.261　0.231±0.082　1.720±0.372 2　0.421±0.271　0.195±0.088　1.247±0.237 3　0.360±0.189　0.168±0.084　1.122±0.378 4　0.233±0.170　0.129±0.068　0.689±0.475 5　0.221±0.065　0.136±0.062　0.831±0.370 6　0.510±0.300　0.248±0.183　1.087±0.571 7　0.158±0.263　0.070±0.120　0.656±0.866 8　0.000±0.000　0.000±0.000　0.000±0.000 9　0.000±0.000　0.000±0.000　0.000±0.000

随着室外放置时间的延长，各基因座与AMEL的峰面积比值逐渐降低。建立自然降解条件下STR/AMEL值随室外放置时间变化的一元三次方程数学模型。

3　讨　论

目前在法医遗传学领域，STR是进行个人识别应用最广泛的遗传标记，个人识别的同时进行DNA降解程度的评估，能够为办案人员提供更多的信息。本研究在探讨控制条件下人工降解DNA，观察STR与AMEL峰面积比值变化与降解程度之间相关性的基础上，进一步研究自然环境下STR与AMEL峰面积比值随放置时间的变化规律，以期能在进行个人识别的同时，评估DNA降解程度。研究结果表明，STR/AMEL值与酶处理时间和室外放置时间均呈现负相关。人工降解及自然降解条件下，一元三次方程能较好地模拟STR/AMEL值随降解时间的变化规律。在人工降解条件下，R2均大于0.99；自然降解条件下，R2均大于0.86。

很多学者［5－6］利用q－PCR对目的片段DNA进行相对定量，然而在一定程度上难以普遍应用；其次，q－PCR技术定量也受很多因素影响，如样本浓度、扩增体系、扩增片段大小等都会影响其扩增效率，从而影响结果的可靠性；另外，运用q－PCR进行定量的过程，将会浪费部分检材，不适合微量检材的鉴定。本研究中，应用标准化的试剂盒和检测程序，能够减少不同实验室之间的差异；同时，在个人识别的同时分析DNA降解程度，能够节省生物检材的用量。因此，应用STR/AMEL值分析DNA降解程度具有一定的优势。

基因组DNA的提取方法也影响STR的分型。陈辉等［7－8］对有机法及Chelex－100法提取组织DNA效果进行了比较，认为Chelex－100法耗时短，提取的DNA量多；酚－氯仿法获得的DNA纯度高，但消化、抽提耗时长，且抽提过程易造成DNA损失。本研究中，人工降解组和自然降解组的DNA分别用不同方法提取，结果显示，在起始时间点，采用酚－氯仿法或Chelex－100法，STR/AMEL值均在较高水平，但Chelex－100法提取中，STR/AMEL值低于用酚－氯仿法提取后STR/AMEL值，考虑与Chelex－100法提取后DNA的纯度不高有关，影响DNA的准确定量。

自然环境中DNA降解过程非常复杂，温度、湿度、光照不同，DNA降解速率也大不相同。对比人工降解与自然降解STR/AMEL值随处理时间及室外放置时间变化规律的方程，发现人工降解条件下，一元三次方程与STR/AMEL值随降解时间的变化规律相关性更高，R2小于人工降解组，提示在自然环境下，DNA降解规律更复杂，受到温度、湿度等因素的影响，仅用一元三次方程难以准确预测STR/AMEL的变化规律。

运用STR/AMEL值推断DNA降解程度存在一个问题，即STR的长度多态性，不同个体的同一STR基因座长度可能不同，相同DNA降解程度下的STR/AMEL值可能表现出差异。因此，进一步研究DNA降解过程中STR基因座各等位基因与AMEL的峰面积比值变化规律，能够更准确地评估DNA降解程度。

参考文献：

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［3］Kitayama T，Fujii K，Nakahara H，et al.Estimation of the detection rate in STR analysis by determining the DNA degradation ratio using quantitative PCR［J］. Leg Med（Tokyo），2013，15（1）：1-6.

［4］Smith BC，Vandegrift E，Fuller VM，et al.Evaluation of degradation in DNA from males w ith a quantitative gender typing，endpoint PCR multiplex［J］.J Forensic Sci，2015，60（2）：399-408.

［5］Ruijter JM，Ramakers C，Hoogaars WM，et al.Amplification efficiency：linking baseline and bias in the analysis of quantitative PCR data［J］.Nucleic Acids Res，2009，37（6）：e45.

［6］Mallona I，Weiss J，Egea-Cortines M.pcrEfficiency：a Web tool for PCR amplification efficiency prediction［J］.BMC Bioinformatics，2011，12：404.

［7］陈辉，刘永波，谢庆瑞，等.有机酚法和Chelex-100法提取不同组织微量DNA效果比较［J］.郑州大学学报（医学版），2004，39（6）：988-991.

［8］李红霞，陈晓晖.精斑检材的3种提取方法比较［J］.中国法医学杂志，2007，22（5）：323-324.

（本文编辑：李成涛）

Application of the Peak Area Ratio of STR Loci to Amelogenin Locus in the Estimation of DNA Degradation

XIE Ya－ling1，LI Lu2，SHAO Cheng－chen1，WU Yi－hui1，DU Tie－shuai1，ZHOU Huai－gu3，LI Hui3，XIE Jian－hui1，SHEN Yi－wen1
（1.Department of Forensic Medicine，School of Basic Medical Sciences，Fudan University，Shanghai 200032，China；2.Jing'an Branch of Shanghai Public Security Bureau，Shanghai 200040，China；3.Shanghai Key Laboratory of Crime Scene Evidence，Key Laboratory of Forensic Evidence and Science Technology，Ministry of Public Security，Institute of Forensic Science，Shanghai Public Security Bureau，Shanghai 200083，China）

Abstract：Objective To explore the change rules of peak area ratio of STR loci to Amelogenin（AMEL）locus（STR/AMEL），a sex－determ ining gene in DNA degradation，and to evaluate the application of STR/AMEL value in the estimation of DNA degradation degree.M ethods DNA was extracted from iliopsoas，and the variations of STR/AMEL value（Penta E/AMEL，Penta D/AMEL，FGA/AMEL）were analyzed after the artificial degradation was made by DNaseⅠ，and the changes of these three ratios of the iliopsoas naturally degraded in an outdoor environmentwere also analyzed.The regression curves were analyzed using the periods of DNA degradation and outside the body as the independent variable（x）and the STR/AMEL value as the dependent variable（y）and three curve equations under two conditions were established.Results Both under the conditions of artificial and natural degradation，STR/AMEL value had a negative relationship w ith the degradation time.The relationship between STR/AMEL and degradation time can be well simulated by the cubic function.R2was over 0.99 under controlled degradation condition and over 0.86 under natural degradation condition.Conclusion The STR/AMEL value（Penta E/AMEL，Penta D/AMEL，FGA/AMEL）is negatively related w ith the DNA degradation degree，which follows mathematical regression models strictly，and itm ight be applied to evaluate the DNA degradation degree.

Key words：forensic genetics；DNA degradation，necrotic；short tandem repeat；peak area

收稿日期：（2015-07-20）

通信作者：沈忆文，女，博士，副教授，主要从事法医学教学、科研及鉴定；E－mail：shenyiwen＠fudan.edu.cn

作者简介：解雅玲（1990—），女，硕士研究生，主要从事法医病理学及法医临床学研究；E－mail：13211010068＠fudan.edu.cn

基金项目：上海市现场物证重点实验室基金资助项目（XCWZ20）

文章编号：1004－5619（2016）02－0105－04

中图分类号：DF795.2

文献标志码：A

doi：10.3969/j.issn.1004－5619.2016.02.007