TCF25干扰慢病毒载体的构建与鉴定

李佑锋，彭　浩，高建芳，高　晶，陈　宇，吴秀山，李永青

(湖南师范大学蛋白质化学及鱼类发育生物学教育部重点实验室心脏发育研究中心， 中国 长沙　410005)



TCF25干扰慢病毒载体的构建与鉴定

李佑锋，彭浩，高建芳，高晶，陈宇，吴秀山，李永青*

(湖南师范大学蛋白质化学及鱼类发育生物学教育部重点实验室心脏发育研究中心， 中国 长沙410005)

摘要为构建一个针对TCF25(transcription factor 25)基因的慢病毒干扰载体, 设计并合成3组针对TCF25的短发夹RNA序列 (shRNA)，通过基因重组技术连入 pLL3.7载体，酶切鉴定及DNA测序后，重组正确的pLL3.7质粒与病毒包装质粒共转染293FT细胞，培养48 h后，分别收集细胞培养上清液，感染H9C2细胞，Western-blot检测TCF25在H9C2细胞中的表达．结果显示TCF25蛋白在H9C2细胞中的表达被抑制．这说明TCF25的慢病毒干扰载体构建成功．

关键词TCF25基因；293FT细胞；H9C2 细胞；慢病毒载体

TCF25(transcription factor 25)是在小鼠胚胎发育过程中广泛表达的一个含有bHLH结构域的转录因子，且其C端还含有一个功能未知的DUF654结构域．根据TCF25广泛的表达模式和包含的转录激活结构域，推测其可能在脑和心脏等各种器官发育过程中发挥重要的调控作用[1-3]．同时，已有研究表明TCF25作为SRF信号通路的抑制因子调控基因的表达，且能够抑制P19CL6细胞向心肌细胞分化[4]，但其具体作用机制需要继续探索．

RNA干扰(RNA interference，缩写RNAi)是指在进化过程中高度保守的双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)诱发的基因沉默现象，能够特异性剔除或关闭靶基因的表达[5]．目前，该技术已被广泛用于探索基因功能和基因治疗领域等[6]．RNAi技术主要是将siRNA序列设计为一段shRNA(short hairpin RNA，短发夹RNA)克隆进质粒载体中，转染细胞后被转录形成一个双链RNA诱导基因沉默发生．慢病毒载体是根据HIV病毒基因特征，利用其基因结构重组构建而成．其能够将外源目的基因或外源的shRNA高效地整合到宿主基因组上并持久表达[7-8]．慢病毒载体能够高效地感染心肌细胞、肿瘤细胞和内皮细胞等各类细胞系．同时，对于原代细胞和不分化细胞等较难转染的细胞，慢病毒载体也能够大大提高目的基因的转染效率和基因整合到宿主细胞基因组上的几率．基于其强大的转染能力，慢病毒载体已经被广泛应用于基础和临床医学研究[9-10]．

为将TCF25的shRNA高效且稳定地导入各类细胞中，本实验拟构建针对TCF25的重组慢病毒载体，用于研究TCF25的功能机制．

1材料与方法

1.1材料

1.1.1载体慢病毒载体系统为3质粒系统，包括pLL3.7，pMD-G，psPAX2(为本实验室保存质粒)．

1.1.2细胞慢病毒包装细胞293FT细胞株，H9C2细胞，COS7细胞，分离的新生大鼠心肌细胞(本实验室保存细胞和分离)．

1.1.3试剂及仪器XhoⅠ,HpaⅠ,NotⅠ和XbaⅠ限制性内切酶,T4连接酶购自上海生工公司；DH5α感受态为本实验室制备和保存；胎牛血清、细胞高糖培养基DMEM和抗生素购自Invitrogen公司；质粒DNA提取试剂盒购自康为世纪生物公司；凝胶回收试剂盒购自OMEGA公司；TCF25抗体购自美国圣克鲁斯生物技术公司；β-actin抗体和辣根过氧化物酶偶联的山羊抗兔抗体购自康为世纪生物公司；倒置荧光显微镜购自OLYMPUS公司；PBS，无水乙醇，Ampicillin和5×SDS上样缓冲液等常用试剂购自上海生工公司；PCR仪、移液枪和CO2培养箱购自德国Eppendorf公司．

1.2方法

1.2.1TCF25基因干扰寡核苷酸的合成利用shRNA在线设计工具针对TCF25基因的核苷酸序列设计3对shRNA单链寡核苷酸片段，干扰shRNA中的loop结构选用了TTCAAGAGA以避免形成终止信号．见表1．设计完成后由上海生工生物公司合成．

表1　shRNA干扰引物序列

1.2.2重组慢病毒干扰质粒pLL3.7-TCF25-RNAi的构建首先将合成的引物配对退火；取2 μg的pLL3.7载体质粒经XhoⅠ/HpaⅠ双酶切后凝胶电泳回收酶切产物；pLL3.7载体质粒胶回收产物与引物退火后产物用T4连接酶连接，16 ℃恒温水浴1 h；连接后转化DH5α感受态，选择Amp抗性LB固体培养基平板进行涂板，37 ℃培养箱过夜；第二天挑菌体单克隆接种到含Amp抗性的LB液体培养基中，37 ℃摇床过夜；质粒提取，酶切和测序鉴定．序列比对正确后，高纯度去内毒素质粒中量抽提试剂盒抽提正确重组的pLL3.7干扰质粒，用于包装病毒．

1.2.3慢病毒的包装与收集用已经培养了24 h的293 FT cells进行病毒的制备：

(a) 取1 mL无血清的DMEM高糖培养液加入EP管中，依次加入：插入shRNA的pLL3.7-TCF25-RNAi质粒8 μg,pMD-G (envolope plasmid)4 μg,psPAX2 (package plasmid)6 μg；再加入Fugene HD转染试剂36 μL，移液枪吸打混匀后室温下静置30 min；

(b) 给293FT细胞更换预热的新DMEM培养液(5 mL/培养皿)，然后用1 mL枪将上步配好的转染溶液均匀地滴加在培养液液面上轻轻摇匀，放入37 ℃培养箱培养12 h；

(c) 12 h后更换10%FBS的DMEM高糖培养液12 mL，24 h后进行GEP绿色荧光表达的检测并开始收集被感染细胞的培养液和换新培养液，连续收集3天，共36 mL于一个50 mL离心管中；

(d) 2 000 r/min在4 ℃下离心10 min，取上清；

(e) 0.45 μm滤器过滤各组干扰TCF25慢病毒上清液，-80 ℃保存备用．

M：DNA标准　图1　对照组pLL3.7和pLL3.7-TCF25-RNAi重组质粒DNA酶切鉴定图　Fig.1　Identification of plasmid pLL3.7 and pLL3.7-TCF25-RNAi by restriction enzyme digestion

1.2.4H9C2细胞中筛选TCF25基因有效干扰序列慢病毒感染细胞前一天将H9C2细胞接种到6孔培养皿中，待细胞浓度为60%～75%时吸去旧培养基，向H9C2细胞中分别加入不含抗生素、10%FBS的DMEM高糖培养液500 μL和慢病毒上清液500 μL，包括未重组pLL3.7(对照组)组、TCF25-RNAi1组、TCF25-RNAi2组、TCF25-RNAi3组；病毒感染24 h后将培养液换为新鲜的10%FBS的DMEM高糖培养液继续培养，转染48 h后观察GFP绿色荧光蛋白的表达；转染72 h后，收集细胞；蛋白提取，取1 mL 过滤灭菌后的PBS清洗细胞2次，加100 μL含蛋白酶抑制剂PMSF(1∶100)的RIPA细胞强裂解液裂解细胞，反复冻融3次；用移液枪吸取裂解液到1.5 mL EP管中， 4 ℃，13 000 g离心10 min，取上清即为蛋白溶液；按比例加入5×SDS蛋白电泳上样缓冲液，沸水浴5 min； 自然冷却后进行SDS-PAGE电泳，转PVDF膜．封闭液(5%脱脂奶粉)室温封闭1 h，TBST稀释的TCF25一抗(1∶250)4 ℃过夜或者室温2 h，TBST稀释的辣根过氧化物酶偶联的山羊抗兔二抗(1∶2 000)室温1 h，内参蛋白抗体为β-actin，各过程间用TBST洗膜3次，每次10 min；显影，蛋白表达结果分析．

1.2.5观察指标重组慢病毒干扰质粒酶切电泳图和质粒测序结果，慢病毒感染细胞后GFP荧光检测，TCF25蛋白的表达．

2结果

2.1pLL3.7-TCF25-RNAi重组质粒酶切和测序结果

见图1，将构建的pLL3.7-TCF25-RNAi1组、pLL3.7-TCF25-RNAi2组和pLL3.7-TCF25-RNAi3重组质粒DNA和对照组PLL3.7通过XbaⅠ和NotⅠ双酶切鉴定，凝胶电泳图显示对照组在450 bp处都会切出一条带，3个实验组在500 bp处都会有一条带，较对照组条带大50 bp左右，证明干扰序列成功连入pLL3.7质粒．

测序结果证实3组pLL3.7-TCF25-RNAi重组质粒DNA上均含有实验设计并合成的干扰靶序列，表明实验成功将TCF25的shRNA双链DNAoligo(干扰引物退火产物)精确地插入pLL3.7载体中，成功构建了干扰TCF25基因mRNA的pLL3.7重组载体质粒．见图2．

图2　pLL3.7-TCF25-RNAi1，pLL3.7-TCF25-RNAi2 和pLL3.7-TCF25-RNAi3质粒DNA 测序结果Fig.2　DNA sequencing of pLL3.7-TCF25-RNAi1, pLL3.7-TCF25-RNAi2 and pLL3.7-TCF25-RNAi3 plasmids

2.2TCF25干扰重组慢病毒的包装和收集

pLL3.7空质粒和3组pLL3.7-TCF25-RNAi重组质粒分别同慢病毒包装质粒 pMD-G 和psPAX2 共同转染293FT细胞，24 h后可见GFP大量表达．连续收集3 d感染细胞上的培养基共36 mL于一个50 mL离心管中．2 000 r/min在4 ℃下离心10 min，取上清．将各组RNA干扰质粒包装的病毒上清液以0.45 μm过滤器过滤，-80 ℃保存．见图3(彩图见封三)．

2.3TCF25重组慢病毒感染H9C2细胞的GFP荧光检测

将包装好的TCF25干扰重组慢病毒上清液转染目的细胞H9C2细胞，48 h后，荧光显微镜观察到较强的绿色荧光表达，证实包装的慢病毒成功转染H9C2细胞．见图4(彩图见封三)．

图3　重组质粒pLL3.7-TCF25-RNAi同慢病毒包装质粒 pMD-G 和psPAX2 共转染293FT细胞后荧光检测结果Fig.3　The green florecence result for contransfecting 293FT cells with pLL3.7-TCF25-RNAi, pMD-G and psPAX2

图4　TCF25-RNAi载体慢病毒转染H9C2 细胞荧光检测结果(×200)Fig.4　Observation of TCF25-RNAi lentiviral vector transfected H9C2 cells with fluorescence microscopy(×200)

2.4Western-blot 检测慢病毒感染后TCF25蛋白表达情况

对各组TCF25重组慢病毒感染后的H9C2细胞总蛋白提取，WB检测TCF25蛋白表达情况．与对照组pLL3.7相比，可观察到RNAi1组、RNAi2组、RNAi3组中TCF25蛋白表达均被抑制，其中RNAi2组中TCF25表达被抑制最明显，表明TCF25-RNAi2干扰序列为最佳干扰靶点．见图5．

图5　Western-blot 检测TCF25的表达Fig.5　Western-blot detection of the expression of TCF25

2.5TCF25重组慢病毒感染分离的新生大鼠心肌细胞和COS7细胞

为了进一步鉴定已包装的TCF25-RNAi载体慢病毒的高效感染能力，检测其对其他细胞的感染活性，分别转染分离的新生大鼠心肌细胞和COS7细胞后都能明显检测到GFP荧光蛋白的表达．见图6和图7(彩图见封三)．

图6　TCF25-RNAi载体慢病毒感染分离心肌细胞荧光检测结果(×200)Fig.6　Observation of TCF25-RNAi lentiviral vector transfected cardiomyocyte cells with fluorescence microscopy(×200)

图7　TCF25-RNAi载体慢病毒感染COS7细胞荧光检测结果(×100)Fig.7　Observation of TCF25-RNAi lentiviral vector transfected COS7 cells with fluorescence microscopy(×100)

3讨论

2014年末美国心脏协会(AHA)对心脏病和卒中的数据统计显示，在全球范围内心血管疾病仍然是死亡的主要原因，每年夺去1 730万人的生命．心血管疾病不再只是西方世界的疾病，全球低、中收入国家中80%的死亡是由心血管疾病引起的[11]．对心脏发育相关的转录因子进行研究，将为心脏病的临床预防和治疗提供新的思路和策略．

bHLH(basic Helix-Loop-Helix，碱性螺旋-环-螺旋)蛋白是一类真核生物中转录因子大家族．bHLH蛋白含有2个保守结构区域，分别为一个能与DNA结合的碱性区域和α螺旋-环-α螺旋结构组成．1989年，在小鼠中bHLH转录因子(E12和E47)首次被鉴定出，随后在各物种得到广泛的鉴定．目前，其转录功能在哺乳动物类内研究最为透彻，参与调控生物体的诸多生命活动，如肌细胞生成、神经元发生、性别决定和细胞增殖等[11-15]．TCF25属于bHLH转录因子亚家族成员，在小鼠和人类各组织中广泛表达，尤其在胚胎发育阶段高表达．有研究表明TCF25作为一个转录抑制因子对SRF信号通路起着极强的抑制作用．同时还有研究发现TCF25基因抑制P19CL6细胞向心肌细胞分化．由此可见，TCF25对于心脏发育具有非常重要的调控功能．

RNAi技术是通过在细胞内形成短的双链RNA结构来介导目的靶mRNA特异性的降解，在转录后水平实现目的基因的沉默．RNAi效应由大小为21～23 bp的shRNA分子所介导，针对目的mRNA不同位点设计的shRNA表现明显不同的活性．shRNA介导的基因沉默效率主要取决于其21～23 bp个碱基序列的合理设计，本实验设计了3对针对TCF25基因mRNA序列不同位点的shRNA干扰引物，分别与pLL3.7质粒连接，成功构建了3对pLL3.7-TCF25重组载体质粒，经过酶切电泳和质粒测序证明与实验设计合成的靶向链完全一致．病毒载体介导shRNA的表达与质粒转染相比，具有感染效率高和转染效果更加稳定的优势．本实验所用病毒包装系统为3质粒系统，分别为病毒包装质粒 pMD-G和psPAX2及高效重组载体pLL3.7．其中pLL3.7质粒含有能表达绿色荧光蛋白(GFP)元件，pMD-G和psPAX2含有病毒包装所必须的元件．

TCF25-RNAi载体慢病毒转染H9C2细胞后， Western-blot检测表明目的蛋白TCF25表达量显著降低；在设计的3个靶点中，第2个靶序列对目的基因表达的干扰作用最明显，为最佳靶点．同时在其他细胞系中实验证明包装的TCF25-RNAi载体慢病毒具有较高的转染效率，为后期进一步研究TCF25基因在心脏发育中的作用机制奠定了良好的基础．

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(编辑WJ)

Construction and Characterization of a Lentiviral Vector for RNA Interference ofTCF25

LIYou-feng,PENGHao,GAOJian-fang,GAOJing,CHENYu,WUXiu-shan,LIYong-qing*

(Center for Heart Department, Key lab of MOE for Department Biology and Protein Chemistry,Hunan Normal University, Changsha 410005, China)

AbstractObjectiveTo construct a lentiviral vector for RNA interference of TCF25 (transcription factor 25) gene and identify it. MethodsThree pairs of complementary short hairpin RNA (shRNA) oligonucleotides targeting the TCF25 gene were designed, synthesized, and then inserted into pLL3.7 vectors by gene recombination technology. The recombinant plasmid was identified by enzyme digestion and DNA sequencing. Correct recombinant plasmids were cotransfected with packaging plasmids into 293FT cells. The cell culture supernatant was obtained after 48 hours, and then applied to infect H9C2 cells. The expression of TCF25 in H9C2 cells was detected by western-blot. ResultsThe recombinant plasmid was successfully constructed. The western-blot showed that the expression of TCF25 in H9C2 cells was inhibited after the cells were successfully infected with the lentiviral vector supernatant. ConclusionThe lentiviral vector interfering TCF25 was constructed successfully.

Key wordsTCF25 gene; 293FT cell; H9C2 cell; lentiviral vector

中图分类号Q786

文献标识码A

文章编号1000-2537(2016)02-0023-06

*通讯作者,E-mail：liyongqing2002cn@aliyun.com

基金项目：国家自然科学基金资助项目(81270156，81470377)；湖南省社会发展支撑计划资助项目(2014SK3009)；湖南省生物发育工程及新产品研发协同创新中心资助项目(2013-448-6)

收稿日期：2015-04-08

DOI:10.7612/j.issn.1000-2537.2016.02.004