呫吨酮衍生物XP—15对BEL—7402细胞线粒体膜电位的影响

陈毅飞　胡龙美　张楠　梁祖鹏　戴支凯

【摘 要】目的：探讨呫吨酮并吡啶衍生物9-（2-吗啡啉乙酰胺基）-7H-吡啶并[4，3-c]呫吨-7-酮（XP-15）对BEL-7402细胞线粒体膜电位的影响。方法：通过MTT法、细胞形态学和克隆实验观察XP-15对BEL-7402细胞增殖的影响；用荧光分光光度计检测线粒体膜电位的影响。结果：高剂量的XP-15能明显抑制BEL-7402细胞增殖（P<0.05）；对BEL-7402细胞克隆的抑制作用，呈剂量和时间依赖性。XP-15作用后，BEL-7402细胞的线粒体膜电位降低（P<0.05）。结论：XP-15诱导BEL-7402细胞凋亡的作用，可能与其降低线粒体膜电位有关。

【关键词】9-（2-吗啡啉乙酰胺基）-7H-吡啶并[4，3-c]呫吨-7-酮；人肝癌BEL-7402细胞；线粒体膜电位

Effect of xanthono-pyridine derivative XP-15 on Human Gastric Carcinoma BEL-7402 cells

CHEN Yi-fei1 HU Long-mei2 ZHANG Nan2 LIANG Zu-peng2 DAI Zhi-kai1

（1.Department of Pharmacology， Pharmaceutical Institute of Guilin Medical College， Guilin Guangxi 541004， China；

2.Department of Pharmacology， Guilin Medical College， Guilin Guangxi 541004， China）

【Abstract】Objective： To investigate mitochondria membrane potential effect of a new xanthono-pyridine derivative 2-morpholino-N-（7-oxo-7H-chromeno[3，2-h]quinolin-9-yl）acetamide（XP-15）on Human Gastric Carcinoma cell line BEL-7402. Methods： Antiproliferative effect of XP-15 on BEL-7402 cells was evaluated by MTT assay， morphological examination and colonial assay. Intracellular mitochondria membrane potential were detected by fluorospectrophotometer. Results： XP-15 could inhibit proliferation of BEL-7402 cells in dose- and time-dependent manner（P<0.05）. After treated with XP-15， mitochondria membrane potential（P<0.05）of BEL-7402 cells were decreased. Conclusion： XP-15 inducing BEL-7402 cells apoptosis might be associated with decreasing mitochondria membrane potential.

【Key words】2-morpholino-N-（7-oxo-7H-chromeno[3，2-h]quinolin-9-yl）acetamide； Human hepatoma BEL-7402 cell line； Mitochondria membrane potential

以呫吨酮（xanthone，氧杂蒽酮） 为母体的化合物主要存在于藤黄科、远志科、桑科等植物中，是近代天然产物中一类重要的活性成分。在传统医学中，含呫吨酮类化合物的药材早已用于多种疾病的治疗[1]。有研究结果显示，呫吨酮类化合物具有抗肿瘤、调节机体免疫、抗炎、降血压、抗氧化、抗血栓形成、抗HIV-1及延缓神经系统退行性疾病进程等活性[2]。肿瘤是临床上的常见病、多发病，目前临床治疗效果尚不理想。呫吨酮类化合物的抗肿瘤应用前景，已引起了医药学界的关注，但相关研究较少[3-5]。因此，利用现代药理学方法，从分离或合成的呫吨酮类化合物中筛选出具有活性的先导化合物，并采用化学修饰等手段，使之成为广谱、高靶向、低毒的抗肿瘤药物，已成为呫吨酮类化合物抗肿瘤研究的当务之急[6]。我们合成了呫吨酮衍生物9-（2-吗啡啉乙酰胺基）-7H-吡啶并[4，3-c]呫吨-7-酮[2-morpholino-N-（7-oxo-7H-chromeno[3，2-h]quinolin-9-yl）acetamide）， XP-15][7]。本研究以人肝癌细胞株BEL-7402为对象，初步探索了XP-15抗肿瘤的可能作用机制。

1 材料和方法[8]

1.1 材料

人肝癌BEL-7402株由中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心提供。胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司；RPMI-1640 培养基为Gibco产品。5氟尿嘧啶（FU）购自上海旭东海普药业有限责任公司。Trizol Regent和Prime ScriptTM RT reagent kit：宝生物工程（大连）有限公司；胰蛋白酶、噻唑蓝（MTT）、二甲基亚砜（DMSO）、Fura-2/AM、Hoechest33258、罗丹明123（R123）和碘化丙啶（PI）均为Sigma公司产品； POWER SYBR？誖GREEN PCR Master Mix：Applied Biosystems，Foster City， CA。550型酶标仪：BioTek Instruments， Inc. USA；DM4000b型荧光显微镜：Leica Microsystems Ltd.， Germany；TU1810型紫外可见分光光度计：荧光分光光度计：Cary Eclipse，Australia；北京普析仪器有限责任公司；iQ5 Multicolor Real-Time PCR Detection System：BioRad Laboratories， Inc.，USA；Mastercycler Gradient Cycler：Eppendorf AG，Germany。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

将BEL-7402细胞接种于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中，于37℃，5% CO2培养箱中培养。在细胞指数生长期时，胰蛋白酶消化，传代培养。

1.2.2 MTT法与培养细胞的观察

5×104·mL-1的BEL-7402细胞接种于96孔板，每孔180μL，分为空白对照组（Control，RPMI 1640）、阳性对照组（FU，100μmol/L，RPMI 1640配制）和5个10倍梯度的试药组（0.01-100μmol/L，RPMI 1640配制），每组设4个平行孔。在结束培养（24h、48h和72h）前4h，加入5 g/L的MTT。结束培养后，弃上清液，每孔加入150μL DMSO，37℃孵育15min，用酶标仪在490 nm检测各孔的吸光值（absorbance value，A value）。计算细胞存活率。重复3次。同时，倒置显微镜下观察药物作用72h后的细胞形态。

1.2.3 细胞克隆

用细胞克隆实验检测XP-15对BEL-7402细胞的长期毒性作用。将指数生长期细胞接种在6孔板，每孔400个细胞。次日，分组给药，24h后，换成无药的完全培养基，在5% CO2、37℃培养箱中培养10d后，在倒置显微镜下计数细胞集落数（每个集落的细胞数大于50个细胞）。计算各给药组的克隆百分比，克隆百分比=给药组的克隆数/阴性对照组的克隆数×100%。

1.2.4 线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential， Δψm） 测定

膜通透性的阳离子荧光染料R123可扩散进入细胞，聚集于带负电位的线粒体，结合基质蛋白后其荧光即淬灭。线粒体膜去极化时，R123释放进入细胞浆，R123荧光恢复。因此，R123荧光强度能反映线粒体膜去极化程度[10]。对数生长期细胞加入500 nmol/L的R123、37°C避光负载30 min后，D-Hanks洗3遍，再用D-Hanks液重悬细胞至4×105·mL-1。荧光分光光度计测定荧光强度（激发波长488 nm，发射波长535 nm）。荧光强度稳定后，加入XP-15。实验结果用给药前的平均荧光强度进行标准化。

1.2.5 统计学分析

2 实验结果

2.1 XP-15对BEL-7402细胞体外增殖的影响

XP-15作用BEL-7402细胞72 h的后（见图1），空白组组细胞形态清晰，密度高。与空白组比，XP-15 100μmol/L剂量组出现细胞碎片，可见贴壁或悬浮的体积缩小的圆形细胞。MTT检测显示（图2A），随给药剂量的增加和作用时间的延长，BEL-7402细胞的存活率逐渐降低。细胞克隆检测显示（图2B），随XP-15剂量的增加，BEL-7402细胞克隆数逐渐减少，其中，XP-15的10μmol/L和100μmol/L组的克隆形成率显著降低。

2.2 Δψm的测定

R123荧光强度检测显示（图3），随XP-15剂量的增加，R123荧光强度逐渐下降。空白对照组的平均荧光强度（a.u.）为20.33±0.25，10μmol/L、50μmol/L和100μmol/L的XP-15作用后的平均荧光强度分别为20.31±0.36（P>0.05）、20.21±0.52和19.86±0.86，均低于空白对照组（P<0.05）。

3 讨论

呫吨酮类化合物具有诱导肿瘤细胞凋亡、阻滞细胞增殖周期和逆转肿瘤细胞的耐药性等生物学活性，在治疗肿瘤方面极具前景[3，6]。为寻找抗肿瘤活性的先导化合物，我们合成了呫吨酮并吡啶衍生物XP-15[7]。结果显示，100μmol/L 的XP-15对BEL-7402细胞增殖的抑制作用明显。随XP-15剂量的增加和作用时间的延长，10μmol/L和100μmol/L的XP-15对BEL-7402细胞克隆的抑制作用明显。以上研究结果提示，XP-15能通过诱导细胞凋亡抑制BEL-7402细胞的增殖。

线粒体功能紊乱也是导致细胞凋亡的的关键环节之一。线粒体膜通透性增加时，可引起线粒体膜电位下降，继而促凋亡因子（如Bad等）的释放、细胞氧化或磷酸化功能障碍，激活细胞凋亡信号通路，最终导致细胞凋亡[8]。本研究的结果显示，XP-15可以剂量依赖性地降低线粒体膜电位，表明XP-15诱导BEL-7402细胞的凋亡可能与其降低线粒体膜电位有关。

综上所述，XP-15能诱导BEL-7402细胞凋亡的作用，可能与其线粒体膜电位， XP-15抗肿瘤机制有待进一步研究。

【参考文献】

[1]赵骁宇，徐增，蓝文健，等.山竹的化学成分及其呫吨酮类化合物的药理作用研究进展[J].中草药，2013，44（8）：1052-1061.

[2]赵建萍，吴玮峰.呫吨酮类衍生物抗肿瘤活性的研究进展[J].中国药业，2012， 21（8）：17-19.

[3]LIN LUO， JIANG-KE QIN， ZHI-KAI DAI， et al. Synthesis and biological evaluation of novel benzo[b]xanthone derivatives as potential antitumor agents[J]. J. Serb. Chem. Soc.， 2013， 78（9）： 1301-1308.

[4]Shen R， Wang W， Yang G. DNA Binding Property and Antitumor Evaluation of Xanthone with Dimethylamine Side Chain[J]. J Fluoresc， 2014， DOI 10， 1007/s10895-014-1380-5.

[5]Azevedo CM， Afonso CM， Sousa D，et al.Multidimensional optimization of promising antitumor xanthone derivatives[J]. Bioorg Med Chem， 2013 Jun 1， 21（11）：2941-59.

[6]DAI ZK， CHENG XJ. Advance of xanthone compounds on antitumor study[J]. Chin Pharm J（中国药学杂志）， 2010， 45（22）： 1701-1704.

[7]QIN JK， HAN LY， YANG ZM， LAN WL， TANG H， SU GF. The preparative methods and application of aminoalkanamido-substituted xanthono-pyridine derivatives： China， 200910114144.9[P]. 2009-11-11.

[8]黄小平，刘晓丹，邓常清.黄芪和三七主要有效成分配伍对氧化损伤所致的PC12细胞凋亡及活性氧、线粒体膜电位的影响[J].中西医结合学报，2012，10（10）：1227-1134.

[责任编辑：杨玉洁]