胃癌p16基因启动子区甲基化状态的研究

白艳丽++金建军++刘献民等

【摘要】 目的 检测胃癌组织中p16基因启动子区域甲基化状态， 并分析其在胃癌发生、发展过程中的作用。方法 应用甲基化特异性PCR技术对42例胃癌组织（胃癌组）、42例癌前病变组织（癌前病变组）、60例正常对照胃黏膜组织（健康对照组）中p16基因启动子区域甲基化状态进行检测， 结合临床病理资料， 分析其在胃癌发生、进展中可能发挥的作用。结果 42例胃癌组织中p16基因启动子区域甲基化阳性率为52.4%， 癌前病变组织中为11.9%， 正常组织中为1.7%， 组间比较差异有统计学意义（P<0.05）。低分化型胃癌组织中p16基因甲基化阳性率明显高于高分化与中分化型胃癌组织， 有淋巴结转移的胃癌组织中p16基因甲基化阳性率明显高于无淋巴结转移组。结论 p16基因甲基化在胃癌发生的促进和进展阶段也发挥着重要作用， 对早期胃癌诊断具有潜在的临床应用价值。

【关键词】 胃癌；p16基因；甲基化

DNA甲基化是目前研究最为深入一种表观遗传学形式[1]。本研究采用甲基化特异性聚合酶链反应（MSP）研究胃癌及癌前病变中p16基因启动子区甲基化状况， 旨在了解胃癌中p16基因启动子区域甲基化与胃癌临床病理指标之间的关系， 以认识p16基因甲基化与胃癌发生、发展的关系。现报告如下。

1 资料与方法

1. 1 一般资料 选取本院2014年10月～2015年7月收治的42例胃癌组织标本作为胃癌组， 其中男27例， 女15例；高/中分化25例， 低分化17例；有淋巴结转移者20例， 无淋巴结转移者22例。所有患者均经病理确诊， 且组织标本前未进行任何抗肿瘤治疗。选取本院同期收治的42例癌前病变胃镜活检标本作为癌前病变组， 包括慢性萎缩性胃炎伴中-重度肠上皮化生18例， 慢性萎缩性胃炎伴中-重不典型增生14例， 中-重肠上皮化生合并中-重不典型增生10例。男27例， 女15例。另取60例胃镜检查的健康人或慢性浅表性胃炎患者作为健康对照组， 排除妊娠、外伤、慢性病毒性肝炎及风湿免疫性疾病。男28例， 女32例。

1. 2 标本采集及DNA提取 标本取下后， 置入做好标记的冻存管中， 立即投入液氮。保存于-80℃冰箱， 以备后用。样本DNA提取：采用TIANamp Macro DNA Kit（天根）试剂盒， 严格按照说明书操作步骤进行。应用EZ DNA Methylation-Gold KitTM对所得血浆循环DNA样本及人甲基化基因组DNA标准品（天恩泽）进行亚硫酸氢盐修饰。

1. 3 甲基化特异性PCR p16基因甲基化（M）和非甲基化（U）序列的特异性引物由上海生工公司合成。琼脂糖凝胶电泳判定PCR产物。

1. 4 统计学方法 采用SPSS19.0统计学软件处理数据。计量资料以均数±标准差（ x-±s）表示， 采用t检验；计数资料以率（%）表示， 采用χ2检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2. 1 MSP产物判定 甲基化引物扩增出目的条带（无论非甲基化引物能否扩增出目的条带）作为阳性结果；非甲基化引物扩增出目的条带且甲基化引物未扩增出目的条带作为阴性结果。

2. 2 胃癌组与癌前病变组、健康对照组p16基因甲基化状态比较 胃癌组42例标本中， 22例为甲基化， 阳性率为52.38%；癌前病变组42例标本中， 5例为甲基化， 阳性率为11.90%；对照组60例标本中， 1例为甲基化， 阳性率为1.67%， 组间差异具有统计学意义（χ2=42.91， P<0.001）， 由正常、癌前病变到胃癌的转化过程中p16基因甲基化阳性率呈逐步增加的趋势。

2. 3 胃癌组不同临床病理特征与p16基因甲基化状态的关系 不同年龄、性别组间的胃癌组织p16基因甲基化阳性率比较差异无统计学意义（P>0.05）；低分化型胃癌组织中p16基因甲基化阳性率82.4%（14/17）明显高于高分化与中分化型胃癌组织32.0%（8/25）， 有淋巴结转移的胃癌组织中p16基因甲基化阳性率80.0% （16/20）明显高于无转移组37.5%（6/16）。

3 讨论

DNA甲基化是指在DNA双螺旋中， DNA甲基转移酶催化下， S-腺苷甲硫氨酸中的活性甲基转移到特定碱基的过程， 其在肿瘤的发生发展过程中起到重要的作用。p16基因的功能产物， p16基因的失活存在于大多数肿瘤中， 失活机制包括基因的缺失和启动子区域高甲基化[2]。本研究发现， 在由正常、癌前病变到胃癌的转化过程中p16基因甲基化阳性率呈逐步增加的趋势， 提示p16基因启动子区域CpG岛甲基化可能是发生于胃癌早期的分子事件之一。低分化组、区域淋巴结转移阳性组p16基因甲基化率显著高于高/中分化组、区域淋巴结转移阴性组， 提示p16基因甲基化在胃癌发生的促进和进展阶段也发挥着重要作用。

肿瘤相关基因的甲基化状态异常可能在肿瘤发生的启动、促进和进展阶段均发挥着重要作用。这种CpG岛高甲基化异常在肿瘤预防和治疗中均有重要的应用价值[3]。DNA甲基化在肿瘤诊断、化疗敏感性和预后评价等方面的应用价值已得到重视。发生DNA甲基化的肿瘤比DNA序列突变肿瘤， 遗传性损伤容易纠正， 经去甲基化治疗特异性地纠正过来， 继而恢复其表达状态， 已被认为是极有发展前景的肿瘤治疗的新手段[4-6]。

参考文献

[1]刘文天， 焦焕利， 杨玉龙， 等. p16基因高甲基化在胃癌发展中的作用.世界华人消化杂志， 2007， 15（26）：2839-2843.

[2]Morris MR， Ricketts CD， Abdulrahman M， et al. Identification of candidate tumour suppressor genes frequently methylated in renal cell carcinoma. Oncogene， 2010， 29（14）：2104-2117.

[3]Peng D， Zhang H， Sun G. The relationship between P16 gene promoter methylation and gastric cancer： a meta-analysis based on Chinese patients. J Cancer Res Ther， 2014， 10 Suppl（8）：292-295.

[4]Zhang P， Pollock RE. Epigenetic Regulators： New Therapeutic Targets for Soft Tissue Sarcoma. Cancer Cell Microenviron， 2015， 1（4）：e191.

[5]Kang N， Shah VH， Urrutia R. Membrane-to-Nucleus Signals and Epigenetic Mechanisms for Myofibroblastic Activation and Desmoplastic Stroma： Potential Therapeutic Targets for Liver Metastasis？ Mol Cancer Res， 2015， 13（4）：604-612.

[6]Cabezas-Cruz A， Lancelot J， Caby S， et al. Epigenetic control of gene function in schistosomes： A source of therapeutic targets？ Front Genet， 2014（5）：317.

[收稿日期：2016-01-22]