火龙果多糖提取纯化及单糖组成检测

秦复霞

摘 要 目的：使用HPLC方法分析火龙果多糖的单糖组成。方法：采用水提、Sevag脱蛋白及柱色谱层析等方法提取、纯化火龙果多糖，之后优化多糖TFA酸水解条件。使用高效液相色谱PMP衍生化法测定火龙果多糖单糖组成。结果：提取到火龙果多糖具有多糖类物质紫外-可见光特征吸收。火龙果多糖最佳TFA酸水解条件为TFA浓度2 mol/L、水解温度120 ℃、水解时间6 h。火龙果多糖主要由葡萄糖、果糖和阿拉伯糖组成。

关键词 火龙果；PMP衍生化；单糖组成；液相色谱

中图分类号：S668.9 文献标志码：A 文章编号：1673-890X（2016）15--03

火龙果是仙人掌科（Cactaceae）三角柱属（Hylocereusundatus Britton et Rose）和蛇鞭柱属（SeleniereusMeja-lantous Britton et Rose）的果用栽培品种，其外观犹如鳞片状因而得名火龙果，又称青龙果、红龙果、仙人掌果等，是一种具有很高观赏性和营养价值的品种[1-2]。火龙果原产于中美洲热带地区，后经移植至东南亚等国后传入我国广东、广西、台湾等地区。因其富含植物性多糖、矿物元素、甾醇及维生素等营养物质[3]，具有增强人体机能、提高免疫力及美容养颜等功效，因此具有广阔的开发前景和利用价值，近年来得到国内外学者的广泛关注[4，5]。本文对火龙果中富含的活性物质植物多糖进行提取、纯化，并采用高效液相色谱法鉴定了其单糖组成，为进一步加工利用火龙果资源提供了理论基础。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

火龙果：购于农贸市场，产地海南。纤维素酶、Sephadex LH-20、单糖对照品（葡萄糖、果糖、半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖、甘露糖）：上海源叶生物科技有限公司。三氟乙酸、重蒸酚、PMP：北京索莱宝科技有限公司。乙腈为色谱纯。甲醇、乙醇、氯仿、正丁醇、浓硫酸、浓盐酸等为分析纯。

DS-I型高速组织捣碎机；真空冷冻干燥机；BS-100A自动部分收集器；KQ5200DE型数控超声波自动清洗器；759MC紫外可见分光光度计；DZF-6050型真空干燥箱；SHB-B95循环水式真空泵；DT5-4B型低速台式离心机；0.45μm水相过滤膜；Zorbax SB C18；安捷伦高效液相色谱仪Agilent 1100。

1.2 火龙果多糖的提取、纯化及鉴定

本实验采用超声辅助的方法提取火龙果多糖，提取参数参考熊建文等人的方法[6]并加以改进。取新鲜火龙果去皮去籽后于组织斩碎器中充分斩碎，之后取适量火龙果果肉浆进行热水回流提取。提取完成后抽滤，将得到的滤液放入真空冷冻干燥机中干燥，得到火龙果组织粗提物。取粗提物10 g溶于200 mL蒸馏水中并加入0.600 g纤维素酶，在最佳条件下水解1 h灭酶冷却，之后于65 ℃下超声提取50 min。结束后4 500 r/min离心15 min，收集上清液。将上清液按液料比1∶4加入氯仿-正丁醇混合液（4∶1）并充分振摇30 min，充分静置溶液分层后弃去沉淀，如此反复3次以除去蛋白质。将溶液冷冻干燥得到火龙果粗多糖。

使用凝胶色谱层析纯化得到的火龙果粗多糖，填料选用Sephadex LH-20。操作步骤：取100 mg火龙果粗糖充分溶解于10 mL超纯水中，使用0.45 μm水相膜过滤后上样。洗脱液为超纯水，流速12 mL/h，每管收集40 min，收集50管。使用苯酚-硫酸法逐管测定490 nm下吸光度，收集洗脱峰并冻干[7]。使用紫外-可见光全光谱扫描法（200～800 nm）鉴定火龙果多糖提取物的性质。

1.3 火龙果多糖TFA酸水解条件优化

火龙果多糖水解条件正交实验因素和水平见表1，采用L9（34）正交实验设计。精确称取火龙果多糖10.0 mg于具塞试管中，加入2 mL不同浓度的三氟乙酸，氮气置换后封管于烘箱中恒定温度下水解一定时间。结束后加入4 mL甲醇溶液充分振摇后放入真空烘干箱中烘干，反复3次以除去三氟乙酸。

表1 火龙果多糖TFA酸水解正交实验因素与水平表

重复 酸浓度/（mol/L） 水解温度/℃ 水解时间/h

1 1 80 3

2 2 100 6

3 4 120 9

1.4 HPLC-DAD法测定单糖组成

1.4.1 单糖对照品和火龙果多糖水解物衍生化

分别取葡萄糖、果糖对照品各3mg于同一试管中，加入0.3 mol/L NaOH溶液5 mL充分振荡。取100 μL溶液加入0.5 mol/L PMP甲醇溶液50 μL，放入70 ℃恒温水浴锅中加热30 min后冷却至室温，之后添加0.3 mol/L盐酸100 μL中和。将衍生化后的糖液按1∶1的料液比与水-氯仿（1∶1）混合液混合并充分振荡离心。弃去氯仿层后再次加入适量氯仿萃取，重复3次以完全除去PMP，然后使用0.45μm水相滤膜过滤后冷藏备用[8，9]。取火龙果多糖水解残渣3mg，处理步骤与对照品单糖相同。

1.4.2 色谱条件

色谱柱采用Zorbax SB C18，流动相为乙腈∶水=25∶75，流速1 mL/min，柱温25 ℃，检测器波长245 nm，进样量10 μL。

1.4.3 系统适用性参数

使用衍生化后的单糖对照品进行系统精密度测定，进样5次，进样量10μL。结果显示，单糖对照品衍生化物峰的保留时间RSD值均小于0.22%，峰面积的RSD值均小于0.51%，理论塔板数不低于3 000。

2 结果与分析

2.1 火龙果多糖提取、纯化及鉴定

火龙果粗多糖柱层析吸光度图谱见图1。火龙果粗多糖经过Sephadex LH-20葡聚糖凝胶纯化后得到一个吸收峰，收集吸收峰对应的试管溶液并进行全光谱扫描，扫描结果见图2。扫描结果显示，吸收图谱是多糖类物质典型的双曲线型，在250 nm和280 nm处无明显吸收，说明几乎不含核酸和蛋白类杂质[10]。

2.2 多糖单糖组成测定

分别取衍生化后的混合单糖对照品和火龙果多糖水解液按照1.4.2中色谱条件进样，六种混合单糖对照品PMP衍生化物HPLC图谱见图3，火龙果多糖水解液衍生化HPLC色谱图见图4。可以看出火龙果多糖由组成葡萄糖、果糖、阿拉伯糖组成。

2.3 火龙果多糖TFA最佳水解条件

以火龙果多糖水解产物洗脱峰面积为指标，使用SPSS12.0统计软件中正交设计分析工具分析测定指标，优化火龙果多糖TFA水解条件。优化结果表明，酸浓度、水解时间、水解温度3个因素间具有显著性差异（P<0.05）。Post Hoc Tests析因分析（α=0.05）表明TFA最佳水解条件为：酸浓度2 mol/L、水解温度120 ℃、水解时间6 h。

3 结论

采用热水回流提取的方法优化了火龙果粗多糖的提取步骤，并通过Sevag法及Sephadex LH-20柱层析纯化提取得到的火龙果粗多糖。经过紫外-可见光全光谱扫描验证得到的火龙果多糖具有一般多糖的特征吸收曲线。优化了TFA法水解火龙果多糖的条件，结果显示，10 mg火龙果多糖中加入2 mL浓度为2 mol/L的TFA，在120 ℃下水解6h得到的单糖产率最高。该方法通过反复加入甲醇以除去TFA，相比其他水解方法提高了后续步骤中液相分析的分辨率并降低了单糖损失。根据单糖类物质经过PMP衍生化后在特定波长处有紫外吸收的特性，本实验设计了PMP衍生化法测定火龙果单糖组成的方法，结果表明火龙果多糖主要由葡萄糖、果糖和阿拉伯糖组成。

参考文献

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[2]朱春华，李进学，龚琪，等.火龙果加工综合利用状况[J].保鲜与加工，2014（1）：57-61，64.

[3]邓仁菊，范建新，蔡永强.国内外火龙果研究进展及产业发展现状[J].贵州农业科学，2011（6）：188-192.

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[6]熊建文，许金蓉，张佳艳，等.酶法辅助超声波提取火龙果多糖及其抗菌活性[J].食品工业科技，2015（17）：229-233，238.

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[10]陈小强，成浩，叶阳，等.茶多糖纯化组分的理化分析[J].中草药，2008（6）：828-830.

（责任编辑：刘昀）