构建原代分离培养与鉴定小鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞的方法及模型

张秋墨 金丹

【摘要】目的：构建能够对小鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞进行分离、原代培养与鉴定的方法，从而对建立稳定高效的细胞膜性起到积极的促进作用。方法：（1）使用低浓度胰酶联合Ⅰ型胶原酶消化法，对小鼠的肺泡Ⅱ型上皮细胞进行分离；（2）经差速离心差速贴壁和免疫黏附法对Ⅱ型上皮细胞进行纯化及原代培养。并倒置显微镜对细胞形态及生长状况进行观察，测定肺泡Ⅱ型上皮细胞的产量、活力以及纯度。对肺泡表面活性蛋白A和C的表达进行免疫细胞化学染色鉴定，使用透射电镜对肺泡Ⅱ型上皮细胞的特异性细胞结构进行鉴定。结果：每只小鼠所获得的肺泡Ⅱ型上皮细胞数量为 ，纯度为 ，细胞活力为 。且原代肺泡Ⅱ型上皮细胞在对倒置显微镜下为立方形或圆形，细胞质内存在许多差别非常明显的细小颗粒，生长方式为岛状；在免疫细胞化学鉴定方面，肺泡表面的活性蛋白A为棕黄色，C为绿色，二者都定位表达于细胞浆；透射电镜可见特征性板层小体及细胞游离面大量微绒毛。结论：胰酶联合胶原酶消化，差速离心差速贴壁和免疫黏附纯化法能够获得产量和纯度都具有优势的AECⅡ，符合一般的体外实验的要求。

【关键词】原代分离；小鼠；肺泡Ⅱ型上皮细胞；方法；模型

1材料和方法

1.1材料

设计：单一样本观察。

地点：XX大学中心实验室。

材料：健康清洁的小鼠6只，雌雄均为3只，体重19～23g。在实验中对动物的处置符合国家《关于善待动物的指导性意见》中的相关规定。

试剂及仪器主要包括DEME培养基、 青霉素、 链霉素、Ⅰ型胶原酶、胰蛋白酶等等以及兔抗鼠SP-A-抗、SP-C-抗、多聚赖氨酸、SABC试剂盒、DAB试剂盒、高速台式离心机、 培养箱以及倒置显微镜和透射电镜等等。

1.2方法

小鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞分离：将小鼠脱颈处死，尽快取下肺组织并洗干净；将其剪成小块；放入10mL的离心管，以2mL/只小鼠的标准加入1g/L胰蛋白酶。将吸管吹打均匀后在37℃的温度孵育5min，将消化好的细胞悬液移除，并加入与之等量的含10%胎牛血清的DEME中止消化；使用同法用1g/L胰蛋白酶对肺组织进行5mim的消化，将消化好的细胞悬液移除并中止消化；在剩余肺组织中，按上述标准加入Ⅰ型胶原酶，孵育15min，移除细胞悬液，加入同上的胎牛血清，中止消化；吸管混匀后用过滤、离心、去上清，用DEME重悬沉淀。

小鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞纯化与培养：将肺细胞悬液接种入包被小鼠1gG的培养皿中，并孵育，吸出含未黏附细胞的液体接种于另一包被小鼠的1gG培养皿中，同法继续孵育2次，并使用胎牛血清重悬沉淀，并接种于培养皿和培养板中，24h后换液，此时贴壁的即为Ⅱ型上皮细胞。

小鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞的鉴定：将其置于6孔培养板内，并使用多聚赖氨酸浸泡，吸出多聚赖氨酸后彻底吹干。对纯化后的肺细胞悬液浓度进行调整并接种于盖玻片，并加入SP-A-抗及SP-C-抗，进行免疫细胞化学操作，然后置于倒置显微镜下观察。

2结果

在AECⅡ的产量、纯度及活力方面，每只小鼠的平均值分别为 、 、 。

倒置显微镜下，免疫黏附纯化后的AECⅡ在接种后的12～18h开始伸展贴壁，形状为圆形活力放心，且有小颗粒，胞核明显。24h后逐渐融合。48h之内为多边形，72h后颗粒减少。六七天后无法辨认Ⅱ型细胞形态。而免疫黏附细胞48h后大量纤维细胞贴壁生长，呈不规则三角形或梭形。

透射电镜下，小鼠AECⅡ呈圆形或立方形，胞质内有小泡，细胞游离面见大量微绒毛。其中图1为倒置显微镜下原代培养的小鼠AECⅡ。

3讨论

就目前的技术来说，从肺组织中将AECⅡ分离出来最常用的方法是酶消化法。常用的消化酶有胰蛋白酶、弹性蛋白酶和胶原酶等。本次研究中使用的是胰蛋白酶联合Ⅰ型胶原酶的方式，而且降低了胰蛋白酶的消化浓度和时间。使用这种方式的目的，一是为了降低胰蛋白酶对肺泡上皮细胞的损伤，二是为了保证AECⅡ获取的数量。胶原酶能够对细胞基质起到消化作用，但对上皮细胞的影响不大。在细胞分离的过程当中，因为酶会对细胞产生一定的损害，细胞释放出DNA，并与细胞外基质形成DNA蛋白复合物，从而将细胞聚集起来。因此，为了使细胞无法聚集成团，经常使用脱氧核糖核酸酶进行控制。在本次研究中，整个分离过程也都存在脱氧核糖核酸。而且，提高细胞活性的条件还包括保持低温、缩短细胞分离的时间。

肺组织中的细胞较多，经过酶消化后得到的细胞悬液中包括AECⅡ、纤维细胞、淋巴细胞等等。这样的AECⅡ是不符合实验研究的需要的，必须对其进行纯化。AECⅡ纯化方法种类较多，例如免疫黏附选择、密度梯度离心法、单克隆抗体技术、贴壁选择以及流式细胞仪筛选等等。每种方式均有自身的优缺点，但部分方法的操作过程较为复杂，而且结果并不是很理想，细胞的数量较少，也容易受损。而使用差速离心差速贴壁和免疫黏附法对其进行纯化，所得到的产量、纯度、活力等均较高。本次研究中分别达到了 、 、 。

AECⅡ的鉴定主要是通过自身的形态及特异性来实现对标志物的表达。AECⅡ特异表达的物质较多，例如SP-A、SP-B、SP-C等等。完全分化的AECⅡ最具代表性的表型是表达表面活性蛋白。在AECⅡ中，SP-A的含量最多，特异性及敏感性较高，检出比较容易，因此是对免疫细胞进行化学鉴定的一种新方式。而SP-C是仅在AECⅡ上表达的唯一活性蛋白，因此也可使用它来进行AECⅡ的鉴定。在本次研究中，同时使用了SP-A和SP-C进行鉴定，相互之间取长补短，使得鉴定结果的可靠性增加，而且在20h就能完成，使得鉴定时间缩短。

结束语：

综上所述，胰酶联合胶原酶消化，差速离心差速贴壁和免疫黏附纯化法能够获得产量和纯度都具有优势的AECⅡ，符合一般的体外实验的要求。

【参考文献】

[1]陈坤，邓世雄，刘芳君等.小鼠胎鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞的分离、原代培养及鉴定[J].西南大学学报：自然科学版，2011，12（12）：123-126

[2]王燕，Aron B.Fisher，宋善路等.抗氧化酶Prdx6保护肺泡Ⅱ型上皮细胞抵抗过氧化氢诱导细胞凋亡的作用[J].实用儿科临床杂志，2012，06（16） ：82-84.