miR—140与膝关节骨性关节炎严重程度的相关性

2016-05-14邓黄河陈志伟

中国医学创新 2016年7期

邓黄河　陈志伟

【摘要】目的：探析miR-140与膝关节骨性关节炎严重程度的相关性。方法：选择本科收治的膝关节骨性关节炎患者60例为骨性关节炎组（OA组），按LawrenceX线诊断标准，Ⅰ～Ⅳ级患者各15例。同时选取同期非骨性关节炎患者30例为对照组（主要为外伤患者）。应用实时荧光定量（PCR）检测上述两组患者膝关节液中miR-140的含量。比较两组及不同等级患者的miR-140表达水平。结果：OA组miR-140表达水平显著低于对照组，比较差异有统计学意义（P<0.01）；miR-140表达水平随OA严重程度增加而降低，比较差异有统计学意义（P<0.01）。结论：miR-140表达水平与膝关节骨性关节炎的严重程度呈负相关。

【关键词】临床观察；膝关节骨性关节炎； miR-140

【Abstract】 Objective：To study the correlation of miR-140 with the severity of knee osteoarthritis.Method：60 patients with knee osteoarthritis were selected as the OA group.According to Lawrence X-ray diagnosis standard，there were 15 cases from level Ⅰ to level Ⅳ respectively.30 cases without OA were selected as the control group at the same time（they were mainly trauma patients）.Through real-time fluorescence quantification，the content of miR-140 in the two groups was detected.The expression levels of miR-140 in the two groups and patients of different degrees were compared.Result：The expression level of miR-140 in the OA group was significantly lower than that in the control group，the difference was statistically significant（P<0.01）.The expression level of miR-140 was reduced according with the increasing of the severity of knee osteoarthritis，the difference was statistically significant（P<0.01）.Conclusion：The expression level of miR-140 is negatively correlated with the severity of knee osteoarthritis..

【Key words】 Clinical observation； Knee osteoarthritis； miR-140

First-authors address：The Peoples Hospital of Xuwen County，Xuwen 524100，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.07.001

骨性关节炎（OA）是一种慢性关节病，典型特征为骨质增生，关节软骨破坏、变性等，多见于老年患者[1]。随着我国人口老龄化的加剧，OA的发病率出现逐年上升的趋势。该病发病率随年龄的增长而增加，特别是55岁之后OA发病率明显增加。OA的发病确切机理目前仍不十分清楚。近年来，有研究显示微小RNA（microRNA）在老年退行性骨关节炎的发病中起着关键作用。已有研究证明，对miR-140的编码基因定向敲除，小鼠可发生与年龄相关的膝关节骨性关节炎样改变，如关节软骨的纤维化、缺失蛋白多糖等[2]。为深入探究人OA及miR-140的相关性的机制，且初步分析下游靶基因的生物信息，笔者对不同分级OA患者的膝关节液进行实时荧光定量PCR检测miR-140表达水平，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料选择本科收治的膝关节骨性关节炎患者60例为关节炎组（OA组），按LawrenceX线诊断标准[3]：Ⅰ～Ⅳ级患者各15例。Ⅰ级患者中男

9例，女6例，年龄27～75岁，平均（41.3±4.5）岁；

Ⅱ级患者中男8例，女7例，年龄27～75岁，平均（41.2±4.4）岁；Ⅲ级患者中男10例，女5例，年龄27～75岁，平均（41.4±4.4）岁；Ⅳ级患者中男10例，女5例，年龄27～75岁，平均（41.4±4.3）岁。同时选取同期非骨性关节炎患者30例为对照组（主要为外伤患者），其中男20例，女10例，年龄27～75岁，平均（41.5±4.2）岁，各组性别、年龄等一般资料比较，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。

1.2 方法（1）标本收集及保存：关节液分离，即采用无酶、无菌的15 mL离心管采集3～4 mL符合实验的膝关节液，室温环境下离心5 min，

3000 r/min，小心吸取上清液，在1.5 mL规格的EP管内分装，-80 ℃置存。（2）提取总RNA：进行TRhol一步法提取，主要为裂解、分层、沉淀RNA、洗涤RNA、溶解RNA等步骤。（3）CDNA反转录：采用TaqMan MicroRNA Reverse Transcriptionit和TaqMan MicroRNAAssays试剂盒中特异性的茎-环状反转录引物，进行反转录反应，反应在Applied Biosystems 2700热循环仪上进行，配置反应液的所有操作均在冰上进行。反应体系见表1。反应条件：16 ℃ 0.5 h，42 ℃ 0.5 h，85 ℃ 5 min。选择总RNA标本：OD260/280值为1.6～2.1。总RNA反应量为100 ng/次。（4）实时荧光定量PCR反应：应用上述TaqMan MicroRNAAssays试剂盒中的PCR引物探针混合液进行PCR扩增及荧光检测。在美国Applied Biosystems公司StepOneTM荧光定量PCR仪上进行反应。反应条件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s及60 ℃ 1 min，后两步共循环50次。PCR产物电泳：应用3%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，60 V，40 min。生物信息分析：进行Targetscan分析预测miR-140下游靶基因。

1.3 统计学处理本研究所得数据采用SPSS 11.5进行统计学处理，计量资料以（x±s）表示，比较采用t检验或秩和检验，以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

OA组的miR-140表达水平为（0.8±0.5），对照组的miR-140表达水平为（2.7±1.2），OA组的miR-140表达水平显著低于对照组，比较差异有统计学意义（t=11.32，P<0.01）；OA严重程度Ⅰ级miR-140表达水平为（2.3±0.9），Ⅱ级miR-140表达水平为（1.8±0.7），Ⅲ级miR-140表达水平为（1.5±0.6），Ⅳ级miR-140表达水平为（0.8±0.4），miR-140表达水平随OA严重程度增加而降低，比较差异有统计学意义（F=5.90，P<0.01）。预测has-miR-140-5P的靶基因，结果有251种靶基因，与OA相关的靶基因有转化生长因子βⅠ型受体、骨形态发生蛋白2，见图1。

3 讨论

膝关节骨性关节炎的整个疾病过程不仅影响到关节软骨，还涉及整个关节，包括软骨下骨、韧带、关节囊、滑膜及关节周围肌肉。膝关节骨性关节炎主要见于老年人，OA导致的痛苦和残疾严重损害了患者的生活质量，并成为最严重的社会经济负担之一。膝关节骨性关节炎的病因可分为原发性和继发性两种；原发性骨性关节炎又称特发性骨性关节炎，多见于体力劳动者、血压高者及女性、超过50岁、体型肥胖者；而继发性膝关节骨性关节炎又称创伤性关节炎，常继发于关节畸形、关节损伤、关节炎症或其他伤病。目前，大多数研究认为可能和患者的遗传易感性、肥胖、骨质疏松、外伤等因素有关[4]。有研究显示，不同种族之间OA的发病率存在一定的差异，例如髋关节骨性关节炎在高加索人种中较为多见，在我国及其他有色人种中较为少见[5]。同时OA存在明显的家族聚集性，这样的结果也说明其发生与遗传存在一定的相关性；肥胖患者OA的发病率显著上升，提示超重可能是OA发病的诱因[6]；骨质疏松者OA的发生率显著增高，可能与软骨下骨小梁变薄、变僵硬时，其承受压力的耐受性就减少有关；创伤造成局部骨质破坏、缺血等，造成骨营养不良，炎症细胞浸润等因素可能导致OA的发生明显增加。OA的发病确切机理目前仍不十分清楚[7]。近年来，有研究显示微小RNA（microRNA）在老年退行性骨关节炎的发病中起着关键作用[8-9]。

本研究探析miR-140与膝关节骨性关节炎的严重程度的相关性，结果显示OA组的miR-140表达水平显著低于对照组，比较差异有统计学意义（P<0.01）；miR-140表达水平随OA严重程度增加而降低，比较差异有统计学意义（P<0.01），膝关节骨性关节炎严重程度与miR-140表达水平呈负相关，与Miyaki等[10]的研究结果大体一致，膝关节骨性关节炎的病变中心是软骨损伤；疾病的第一征象为胶原纤维支架的分离，破损软骨承受应力的能力降低，导致软骨下骨承受相对较低的应力而发生微骨折，修复后的骨组织失去正常的弹性，引发关节软骨的进一步损伤[11-12]；软骨基质蛋白多糖生物合成和分解异常，软骨细胞无法合成正常的具有长链结构的透明质酸和聚氨基葡萄糖，由此产生的短链蛋白多糖聚合物由胶原网状结构中溢出，导致关节软骨局部软化、失去弹性、磨损及结构破坏；继发反应有超氧化物自由基、胶原酶和磷脂酶的激活，进一步导致软骨的损伤并引发关节相邻骨骼的骨性关节炎反应[13]；miR-140micRNAs的家族成员为miR-140，某些软骨中可表达miR-140，且可对软骨发育进行调节，软骨组织中特异性表达miR-140且其表达水平的改变可致病[14]。软骨细胞中可生成成熟的miR-140，在膝关节骨性关节炎中表达水平下降可能源于膝关节骨性关节炎患者的软骨细胞出现病理性变化，生成miR-140下降；可影响Dicer酶及Drosha酶活性的因素引发miR-140生成减少；OA患者软骨细胞出现凋亡，引发miR-140降解；OA病情进展促进miR-140的降解因素的增加，miR-140抑制降解因素下调，miR-140表达水平减低。同时有研究发现，PDGF受体中含有负性调节作用的miR-140结合位点，miR-140基因可通过PDGF信号途径调节PDGF受体蛋白水平，表明miR-140与软骨的发育密切相关。miR-140在体内平衡及软骨发育过程中发挥着重要的作用，对miR-140目标基因的敲除，建立动物实验模型，研究结果显示，miR-140可以对软骨的发育进行调节，miR-140缺失引发关节软骨的纤维化及蛋白多糖的丢失符合年龄相关的膝关节骨性关节炎样变化[15-16]。综上所述，miR-140表达水平与膝关节骨性关节炎的严重程度呈负相关。

参考文献

[1]汪来杰，张飞，杜桂夏.人工关节置换术治疗膝关节骨性关节炎的疗效观察[J].中外医学研究，2014，12（31）：25-26.

[2]姜贵云，鞠智卿，杨晓莲，等.玻璃酸钠关节腔内注射配合蜡疗和超激光治疗老年膝关节骨性关节炎60例[J].中国老年学杂志，2013，33（6）：702-704.

[3]李杰文，肖立军，刘俊.关节镜微创治疗膝关节骨性关节炎的疗效观察[J].中外医学研究，2013，11（19）：180-181.

[4]姬登高，张国强，张伟.盐酸氨基葡萄糖联合独活寄生丸治疗膝骨性关节炎临床疗效观察[J].中外医学研究，2014，12（31）：10-12.

[5]田煜平，彭飞，姚亚洲，等.关节腔内注入玻璃酸钠与激素治疗膝关节骨性关节炎的Meta分析[J].中国全科医学，2011，14（21）：173-174.

[6]何辉，刘伟，刘德玉.透明质酸钠联合热敷散治疗膝关节骨性关节炎临床观察[J].中外医学研究，2013，11（34）：36-37.

[7]杨子新.中药熏蒸治疗膝关节骨性关节炎的临床疗效分析[J].中外医学研究，2014，12（19）：136-137.

[8]苗贵强，谭文成，吴昊，等.玻璃酸钠治疗中度膝关节骨性关节炎的远期疗效[J].暨南大学学报（自然科学与医学版），2011，32（2）：218-220.

[9]张明，刘立宏，肖涛，等.实时荧光定量PCR检测骨性关节炎病人膝关节液中miR-140的表达[J].中南大学学报（医学版），2012，37（12）：1210-1214.

[10] Miyaki S，Sato T，Inoue A，et al.MicroRNA-140 plays dual roles in both cartilage development and homeostasis[J].Genes Dev，2010，24（11）：1173-1185.

[11]林桦楠，陈海鹏.膝关节骨性关节炎关节镜术后注射玻璃酸钠的临床研究[J].中国医学创新，2013，10（3）：8-9.