水稻BRI1启动子克隆与表达载体构建

田翠霞 魏强 李宪彬

摘要：为探究拟南芥和水稻BRI1基因差异表达的原因，本研究克隆了OsBRI1启动子，并将其构建在植物表达载体pCambia2300-GUS上，为进一步转化拟南芥或其他植物并研究其表达模式奠定了基础。

关键词：水稻；油菜素内酯；OsBRI1

中图分类号：S511+Q78文献标识号：A文章编号：1001-4942（2016）08-0001-05

AbstractIn order to explore the reasons for expression difference of BRI1 in rice and Arabidopsis thaliana， we cloned the OsBRI1 promoter and connected it on the plant expression vector pCambia2300-GUS. These results laid foundations for further transformation into Arabidopsis or other plants and study on its expression patterns.

KeywordsRice； Brassinosteroids； OsBRI1

植物激素（plant hormone）是植物体内产生的一类在很低浓度时即可对植物的生长发育、代谢、环境应答等生理过程产生重要调控作用的代谢产物，在植物生长过程中扮演着极其重要的角色。植物中最早发现的一类甾醇类激素是芸苔甾内酯（brassinolide， BL）[1]。到目前为止，已发现60多种具BL结构的类似物，广泛存在于植物的不同组织和器官中，由于它们的功能与BL相似，统称为油菜素甾醇类物质（brassinosteroid， BR）[2-4]，BL是油菜素甾醇类成员中生物活性最强的一种分子。随着BR结构鉴定和人工合成BR的出现，科学家们进行了大量的生理学研究，不仅确定了BR在多种植物中的促生长作用，还揭示了BR的多种其它功能，包括种子萌发、气孔形成、维管分化、株型、开花、雄性可育性和抑制衰老等[5]。外施具生物活性的BR能增强植物对各种胁迫的抗性，包括生物和非生物胁迫[6-8]。自20世纪80年代起，BR已被广泛用于增加农作物和蔬菜的产量。在水稻中，BR影响许多农艺性状如粮食产量、株高、叶角、籽粒大小和分蘖数等[9，10]。

BR的感知和信号传递过程需要众多基因参与，首先通过一个定位于细胞膜上的富含亮氨酸重复序列（leucine-rich repeats， LRRs）的跨膜类受体蛋白激酶BRI1 （brassinosteroid insensitive 1） 感知传递信号[11，12]，然后才能激活一系列的信号级联传递[13，14]。利用AtBRI1启动子在野生型拟南芥中驱动GUS表达，显示AtBRI1在根、茎、叶柄及叶中广泛表达[15]。采用RT-PCR技术，检测水稻各组织器官中OsBRI1的表达模式，其主要在芽中表达，在根部表达不明显[16]。本文构建了OsBRI1启动子（pOsBRI1）的表达载体，为利用pOsBRI1在野生型拟南芥中驱动GUS报告基因的表达，在同一水平观察水稻和拟南芥BRI1的表达位置及表达量的差异，以及揭示OsBRI1基因的表达特征奠定基础。

1材料与方法

1.1材料与试剂

1.1.1试验材料水稻日本晴基因组DNA。

1.1.2菌株和载体大肠杆菌DH5α感受态细胞、pCambia2300-GUS载体质粒由陕西师范大学生命科学学院进化发育实验室保存。克隆载体pMD19-Simple购自宝生物工程（大连）有限公司。

1.1.3酶、试剂盒及其他耗材LA Taq酶、Sal Ⅰ、BamHⅠ、T4 DNA Ligase、6×DNA Loading Buffer、DNA Marker、dNTP Mixture 购自宝生物工程（大连）有限公司；KOD FX（附有dNTPs，KOD Buffer） 购自KOD公司；NheⅠ、RNA溶解酶溶液购于NEB公司；EasyPure Quick Gel Extraction Kit、EasyPure Plasmid MiniPrep Kit购自Omiga；其他药品试剂均为进口或国产分析纯。

1.1.4引物和测序PCR引物合成及DNA测序工作由南京金斯瑞生物工程股份有限公司完成。

1.2试验方法

1.2.1引物设计根据TAIR （The Arabidopsis Information Resource）网站上AtBRI1的基因序列，在网站Phytozm中查找水稻日本晴BRI1基因，定义起始密码子ATG上游2 000 bp为启动子序列。根据表达载体pCambia2300-GUS插入位点的酶切位点设计PCR引物，pOsBRI1-F： 5′-GCGTCGACCCCAATGCATGGATAGTTTAGGTTG3′ （下划线为限制性内切酶SalⅠ的酶切位点），pOsBRI1-R： 5′-CGGGATCCGAAGTGATGAGGAGGAGATGGAGAGAG-3′ （下划线为限制性内切酶BamHⅠ的酶切位点）。

1.2.2启动子克隆以水稻日本晴基因组DNA为模板，用设计的引物进行PCR扩增。PCR反应体系50 μL：2×PCR Buffer for KOD FX 25 μL，2 mmol/L dNTPs 10 μL，10 pmol/μL上下游引物各1.5 μL，Template DNA 1 μL，1.0 U/μL KOD FX 1 μL，最后加ddH2O将反应体系调至50 μL。PCR反应程序： 95℃预变性5 min；98℃变性15 s， 58℃退火30 s， 68℃延伸2 min 20 s，循环25次；68℃延伸10 min，16℃恒温保存。PCR产物经0.8%的琼脂糖凝胶电泳分离，用凝胶成像系统检测并记录结果。将PCR回收产物加A，纯化，与载体pMD19-Simple连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆抽提质粒进行酶切检测，将检测的阳性质粒送去测序。

1.2.3表达载体构建将测序正确的质粒及pCambia2300-GUS载体质粒进行SalⅠ、BamHⅠ双酶切。酶切体系为：pOsBRI1质粒5 μL，SalⅠ、BamHⅠ各0.5 μL，1.5×T Buffer 2 μL加ddH2O平衡反应体系终体积到20 μL；同时在另一小EP管中加入pCambia2300-GUS载体质粒5 μL，SalⅠ、BamHⅠ各0.5 μL，1.5×T Buffer 2 μL加ddH2O平衡反应体系终体积到20 μL。将以上两个酶切体系同时置于37℃保温箱中反应3 h。酶切结束后用2%的琼脂糖凝胶电泳纯化反应产物，并回收目的片段及载体片段。用T4连接酶将目的片段连接到pCambia2300-GUS载体上。连接体系10 μL：pCambia2300-GUS载体1.5 μL、目的片段7 μL、T4 DNA连接酶0.5 μL、10×T4 DNA ligase Buffer 1 μL，16℃反应12 h。载体构建示意图见图1。将连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，挑选阳性抗性菌落进行PCR检测，将阳性菌落扩大培养，提质粒，进行双酶切再检测。

2结果与分析

2.1OsBRI1启动子的克隆

以水稻日本晴基因组DNA为模板，用pOsBRI1-F和pOsBRI1-R为引物，进行PCR扩增。电泳检测结果（图2）显示，扩增出2 000 bp左右的条带，与预期目的片段大小相符。

将回收的PCR产物加尾纯化后连接到pMD19-Simple 载体上，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑选白色单菌落，使用菌落PCR方法进行初步筛选，将菌落PCR检测得到的阳性菌抽提质粒，进行双酶切（SalⅠ和BamHⅠ、NheⅠ和BamHⅠ）及单酶切（NheⅠ）检测，由图3可知，酶切片段与预期相符，说明目的片段已连接到载体上。将检测阳性的质粒进行测序，测序结果与Phytozm网站提供的水稻日本晴序列对比结果见图4，说明基因未发生突变。

2.2表达载体构建

将OsBRI1启动子经酶切连接到pCambiaM：DNA Marker；1：SalⅠ与BamHⅠ双酶切片段；2：NheⅠ单酶切片段；3：NheⅠ和BamHⅠ双酶切片段；SalⅠ与BamHⅠ双酶切片段分别长2 065、2 692 bp；NheⅠ单酶切片段长4 757 bp；NheⅠ和BamHⅠ双酶切片段分别长1 224、3 533 bp。

2300-GUS表达载体上，转化大肠杆菌DH5α，对阳性菌抽提质粒进行双酶切（SalⅠ和BamHⅠ）鉴定（图5），结果显示pOsBRI1成功连接到pCambia2300-GUS表达载体上。

3讨论与结论

BR是一种广泛存在于植物中的类固醇激素，通过位于细胞膜上的跨膜类受体蛋白激酶BRI1感知和传递信号。已有的研究表明，拟南芥BRI1在整个植株内广泛表达，但水稻BRI1在根部表达不明显。BRI1在水稻和拟南芥中的表达差异是基因本身造成的还是由于启动子区的差异所致，为了探究其原因，我们对十字花科和禾本科BRI1基因序列进行比对，发现BRI1的编码序列保守，但其启动子区存在多样性，由此推测，启动子区的多态性可能导致BRI1蛋白在水稻和拟南芥中的表达差异。因此，我们根据已经公布的水稻日本晴基因序列，结合表达载体pCambia2300-GUS上的酶切位点，设计引物克隆得到OsBRI1启动子，并成功连接到pCambia2300-GUS载体上。该研究为进一步研究十字花科与禾本科BRI1表达差异奠定了基础，以期为深入探究水稻的BR信号转导机制做出贡献。

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