3种常用防腐剂复配对致病菌抑菌效果比较

陈　雪，　史得君，　黄柏申，　沈　月，　杨　丽，　崔承弼*

(1.延边大学农学院，吉林 延吉 133002；2.中国农业科学院农产品加工研究所，北京 100193 )



3种常用防腐剂复配对致病菌抑菌效果比较

陈雪1,2，史得君1，黄柏申1，沈月2，杨丽2，崔承弼1*

(1.延边大学农学院，吉林 延吉 133002；2.中国农业科学院农产品加工研究所，北京 100193 )

摘要：为降低食品中防腐剂的添加量，同时达到预期的防腐效果，试验以山梨酸钾、双乙酸钠和脱氢乙酸钠3种常用防腐剂为研究对象，经不同添加比例复配处理，采用酶标比浊法观测其复配防腐剂对致病菌株革兰氏阴性(G-)菌肠炎沙门氏菌、福氏志贺氏菌和革兰氏阳性(G+)菌金黄色葡萄球菌的抑菌性影响。并对其结果中最优复配组合进行浓度稀释，观测不同稀释比例复配组合防腐剂的抑菌效果变化趋势。结果表明：复配防腐剂中山梨酸钾和双乙酸钠添加量为50∶50和75∶25时，对沙门氏菌的抑制能力最强；山梨酸钾与双乙酸钠复配比例为50∶50时和山梨酸钾∶双乙酸钠∶脱氢乙酸钠为50∶25∶25时，对志贺氏菌抑制能力最强；山梨酸钾和脱氢乙酸钠添加量为75∶25时，对金黄色葡萄球菌的抑制能力最强；当3种防腐剂复配比例为山梨酸钾∶双乙酸钠∶脱氢乙酸钠为50∶25∶25时，对3种致病菌的抑制能力均较好；最优复配组合浓度稀释试验中，抑菌性均随着浓度的减小而降低，但并不是呈线性比例降低，上述3个组合防腐剂复配的稀释比例为原来70%降到50%时，对致病菌的抑制效果不存在显著差异。因此，复配可以提高防腐剂的抑菌性，且复配防腐剂的抑菌性在一定浓度范围内稳定。

关键词：复配；防腐剂；抑菌效果

防腐剂是指用于防止食品在储存、流通过程中，由于微生物繁殖引起的变质，或由于储存、销售条件不善，食品内在品质发生劣变，为提高保存期，延长食用价值而在食品中使用的添加剂[1]。随着人们生活水平的日益提高，食品供应种类也愈加丰富，但随之而来的食品安全问题也层出不穷。防腐剂能有效地抑制食品中微生物的生长繁殖，延长食品的贮藏期，在加工食品中有着不可取代的作用[2-4]。但过多地摄入防腐剂会对人体产生一定的毒害作用[5]，加之近些年防腐剂的滥用，以及宣传上的不到位，已经使防腐剂的应用成为消费者极度敏感的问题[6-8]。为取得更好的防腐效果，人们考虑将多种防腐剂复配混合使用[9-10]，利用它们的协同作用降低防腐剂的添加量[11-12]。如何有效地使用多种添加剂，郭镧等[13]研究复配防腐剂那他霉素和单辛酸甘油酯(复配比例0.18∶0.4)为年糕最优复配防腐剂，该复配防腐剂的使用可以尽量保持年糕原有风味的同时延长年糕保质期；荆亚玲等[14]研究得出，丙酸钙与脱氢醋酸钠两者复配的比例为6∶4时，更有利于延长面包的保质期；陈思奇等[15]研究表明，0.026 8%山梨酸钾与0.01%乳酸链球菌素组成复配防腐剂，能满足对中性饮料的防腐要求等。但是关于复配防腐剂的研究还不够深入，不能满足人们对各类食品需求日益增长的要求。

随着我国食品工业的日益发展，防腐剂作为一类主要的食品添加剂在食品工业中被广泛应用。与国外相比，我国生产企业普遍存在的问题是：合成技术落后、工艺不完善、生产成本高[16]。因此，开发抗菌性强、安全无毒、适用性广和性能稳定的食品防腐剂是食品科学研究的热点之一[17]。

本研究以应用于加工蔬菜中的3种食品防腐剂山梨酸钾、双乙酸钠和脱氢乙酸钠为防腐剂复配的研究对象，以革兰氏阴性菌沙门氏菌、志贺氏菌和革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌为目标菌株进行抑菌效果比较试验，选出最优复配组合。在食品加工中，防腐剂在一定的浓度范围内均能达到较好的防腐效果，这对食品的生产加工具有一定的实际意义。因此后续试验中对其最优的复配比例组合进行适当浓度的稀释，旨在选出防腐剂抑菌性相对稳定的浓度区间。

1材料与方法

1.1材料与设备

山梨酸钾、双乙酸钠、脱氢乙酸钠购于上海源叶生物科技有限公司。肠炎沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、福氏志贺氏菌购于中国工业微生物菌种保藏中心。营养肉汤、TSA培养基购于北京陆桥技术有限公司。

LX-C不锈钢立式压力蒸汽灭菌器(合肥华泰医疗设备有限公司)，超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)，BSD-100振荡培养箱(上海博讯实业有限公司)，I-mark酶标仪(美国Bio-Rad公司)。

1.2方法

1.2.1菌悬液的准备

挑取斜面菌种置于含有20 mL相应无菌液态培养基的锥形瓶中，在适宜温度下培养24 h后，用无菌液态培养基稀释至105CFU/mL备用。

1.2.2最佳防腐剂复配组合筛选

1) 3种防腐剂复配组合设计防腐剂复配使用量的确定是根据荆亚玲[14]实验方法并进行改动，按照《食品添加剂使用标准 》GB2760-2014中的规定，在蔬菜加工中防腐剂单独使用时最大使用量为:山梨酸及其钾盐的最大使用限量为0.5 g/kg(以山梨酸计)，折合成山梨酸钾的最大使用限量为0.665 g/kg；脱氢乙酸钠(以脱氢乙酸计) 的最大使用限量为 0.3 g/kg，折合成脱氢乙酸钠的最大使用限量为0.34 g/kg；双乙酸钠的最大使用限量为1.0 g/kg。同时按《食品添加剂使用标准 》GB2760-2014附录 A(食品添加剂的使用规定)A.2的规定，同一功能的食品添加剂(相同色泽着色剂、防腐剂、抗氧化剂)在混合使用时，各自用量占其最大使用量的比例之和不应超过1。本试验按照以上2个标准对其山梨酸钾、双乙酸钠和脱氢乙酸钠进行复配处理，复配添加量=各自用量占其最大使用量的比例之和等于1进行添加，具体试验设计如表 1。

表1　3种防腐剂复配的添加比例

注：山梨酸钾、双乙酸钠、脱氢乙酸钠制成其最大使用限量的0、25%、50%、75%、100%的溶液浓度分别为0、0.166、0.332、0.499、0.665 g/kg；0、0.25、0.5、0.75、1.00 g/kg；0、0.085、0.17、0.255、0.34 g/kg。

2) 防腐剂抑菌性检测将配制好的防腐剂用相应的液态培养基配成所需质量浓度。吸取100 μL液态防腐剂到96孔细胞培养板中，再将备用菌悬液吸取100 μL到孔中混匀(每个样做3个平行)，立即用酶标仪测其光密度值，然后在所需培养温度下振荡培养24 h后再次用酶标仪测其光密度值，以2次光密度值的差值来表示每个孔中菌含量的变化。本试验以培养前后菌液中含菌量的变化来表示防腐剂抑菌性的大小，含菌量变化越大，即菌含量生长越多，则防腐剂抑菌性越低。

1.2.3复配组合浓度筛选

由上述试验结果可得每种试验菌株抑菌效果最好的复配组合比例。将其最优的复配比例进行浓度稀释，分别稀释为表1中原浓度的90%、80%、70%、60%、50%和40%。稀释后的防腐剂抑菌性检测方法同2)。

1.3数据分析

利用SAS软件进行方差和显著性分析。

2结果与分析

2.13种防腐剂复配对3种致病菌抑菌效果比较

由表2可知，不同复配组合对沙门氏菌的抑制能力表现为：12号组合即山梨酸钾与双乙酸钠复配比例为50∶50，抑菌浊度值为0.553；14号组合即山梨酸钾与双乙酸钠复配比例为75∶25，抑菌浊度值为0.579，这2组对沙门氏菌抑菌效果最好。组合号11号为3种防腐剂复配的组合之一，对沙门氏菌抑制能力较强；15号、5号、1号组合分别为单独添加山梨酸钾、双乙酸钠和脱氢乙酸钠，对沙门氏菌的抑制能力呈依次递减趋势；当脱氢乙酸钠分别与山梨酸钾和双乙酸钠复配时对沙门氏菌的抑制能力均相对较弱，且双乙酸钠与脱氢乙酸钠复配时对沙门氏菌的抑制能力相对最弱。实验选取最优抑菌组合中的12号进行下一步复配防腐剂浓度稀释试验。

表2　3种防腐剂复配对几种致病菌的抑菌效果比较

续表2　3种防腐剂复配对几种致病菌的抑菌效果比较

注：同列不同小写字母表示在P<0.05时差异显著。

不同复配组合对志贺氏菌的抑制能力表现为：12号组合即山梨酸钾与双乙酸钠复配比例为50∶50，抑菌浊度值为0.064；11号组合即为山梨酸钾∶双乙酸钠∶脱氢乙酸钠为50∶25∶25抑菌浊度值为0.067，是对志贺氏菌抑菌效果最好的2组。9号组合和14号组合也为山梨酸钾和双乙酸钠不同比例的复配组合，对志贺氏菌的抑制能力均较强；8号组合为3种防腐剂复配的组合之一，对志贺氏菌的抑制能力较强；15号、5号、1号组合为单独添加山梨酸钾、双乙酸钠和脱氢乙酸钠，抑制能力表现为山梨酸钾和双乙酸钠对志贺氏菌的抑制能力较强，脱氢乙酸钠抑制能力相对较弱；当脱氢乙酸钠分别与山梨酸钾和双乙酸钠复配时对志贺氏菌的抑制能力均相对较弱。试验选取最优抑菌组合中的12号进行下一步复配防腐剂浓度稀释试验。

复配组合对金黄色葡萄球菌的抑制能力表现为：13号组合即山梨酸钾与脱氢乙酸钠复配比例为75∶25，抑菌浊度值为0.13，是对金黄色葡萄球菌抑菌效果最好的一组。10号组合也为山梨酸钾和脱氢乙酸钠不同比例的复配组合，对金黄色葡萄球菌的抑制能力较强；11号组合为3种防腐剂复配的组合之一，对金黄色葡萄球菌的抑制能力较强；单独添加山梨酸钾、双乙酸钠和脱氢乙酸钠的15号、5号和1号组合，表现为山梨酸钾对金黄色葡萄球菌的抑制能力相对较强，脱氢乙酸钠次之，双乙酸钠抑制能力相对较弱；当双乙酸钠分别与山梨酸钾和双乙酸钠复配时对金黄色葡萄球菌的抑制能力均较弱。试验选取最优抑菌组合13号进行下一步复配防腐剂浓度稀释试验。

3种致病菌的最佳抑菌组合并不相同，但是在食品中无论是革兰氏阳性菌还是革兰氏阴性菌都有较高的危害性和普遍性，所以找出一种对这3种致病菌均具有较强抑菌性能的复配组合更具有实际意义。综合表2数据可知，11号组合即复配比例为山梨酸钾∶双乙酸钠∶脱氢乙酸钠为50∶25∶25，对3种致病菌均呈现出较强的抑菌能力。

2.2稀释后防腐剂组合对3种致病菌的抑菌效果比较

2.2.1稀释后12号防腐剂组合对沙门氏菌的抑菌效果比较

由表2可知，组合号12号即山梨酸钾与双乙酸钠复配比例为50∶50，对沙门氏菌的抑菌效果最好，应采用12号组合的复配比例进行浓度梯度稀释。

注：横坐标为表1中原复配组合的不同稀释浓度，不同小写字母表示在P<0.05时差异显著，下同。

图1稀释后防腐剂12号组合对沙门氏菌的抑菌效果比较

Fig.1Comparison of antibacterial activity of No.12

combination on Salmonella enteritidis after dilution

由图1可知，当稀释浓度为原来的90%和80%时，与未稀释复配防腐剂组合相比，含菌量有所增加，即防腐剂组合的抑菌能力有所下降，但数据分析表明，这3个稀释浓度的组合之间抑菌效果无显著差异。在浓度稀释至70%时，与稀释浓度80%时相比抑菌能力显著下降。稀释浓度为70%、60%和50%的防腐剂对沙门氏菌的抑菌能力不存在显著差异。稀释浓度为40%时，防腐剂对沙门氏菌的抑制能力显著下降。综上所述，就最佳复配组合而言，其对沙门氏菌的抑菌性随着浓度的减小而降低，但7个稀释浓度间并非全部存在显著差异。未稀释的防腐剂和稀释浓度为80%的防腐剂区间与稀释浓度为70%和50%的防腐剂区间其抑菌性均没有显著性差异。

2.2.2稀释后12号防腐剂组合对志贺氏菌的抑菌效果比较

由表2可知，12号组合即当山梨酸钾与双乙酸钠复配比例为50∶50时，其对志贺氏菌的抑菌效果最好，采用12号组合的复配比例进行浓度稀释。

由图2可知，当防腐剂组合稀释比例为原来的90%和80%时，与未稀释复配防腐剂对志贺氏菌的抑菌能力相比有所下降，数据分析表明，其间存在显著差异，但90%和80%稀释比例间无显著差异。当稀释比例为原来的 70%时，抑菌能力继续下降，与稀释浓度80%时存在显著差异。当稀释浓度为60%和50%时，其下降速度较为缓慢，与70%时的抑菌能力不存在显著差异；当稀释浓度为40%时，其对志贺氏菌的抑制能力显著下降。综上所述，就最佳复配组合而言，其对志贺氏菌的抑菌性随着浓度的减小而降低，但7个稀释浓度间并非全部存在显著差异。稀释浓度为90%和80%的防腐剂区间与稀释浓度为70%和50%的防腐剂区间其抑菌效果均没有显著性差异。

图2　稀释后12号防腐剂组合对福氏志贺氏菌的抑菌效果

2.2.3稀释后13号防腐剂组合对金黄色葡萄球菌的抑菌效果比较

由表2可知，13号组合即当山梨酸钾与脱氢乙酸钠复配比例为75∶25时，其对金黄色葡萄球菌的抑菌效果最好，采用13号组合的复配比例进行浓度稀释。

由图3可知，当防腐剂组合稀释比例为原来的90%、80%和70%时，与未稀释复配防腐剂对金黄色葡萄球菌的抑菌能力相比有所降低，数据分析表明，其4个浓度稀释间存在显著差异。当稀释浓度为60%和50%时，其对金黄色葡萄球菌的抑菌能力下降速度较为缓慢，与70%时的抑菌能力相比不存在显著差异；当稀释浓度为40%时，其对金黄色葡萄球菌的抑制能力显著下降。综上所述，就最佳复配组合而言，其对金黄色葡萄球菌的抑菌性随着浓度的减小而降低，但7个稀释浓度间并非全部存在显著差异。稀释浓度为70%和50%的防腐剂区间抑菌效果没有显著性差异。

图3　稀释后13号防腐剂组合对金黄色葡萄球菌的抑菌效果比较

由图1～3可知，在最优复配组合浓度稀释试验中，抑菌性均随着浓度的减小而降低，但并不是呈线性比例降低，且在上述3个组合中，防腐剂复配的稀释比例为原来的70%和50%时，对沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌的抑制效果均不存在显著差异。

3结论

对沙门氏菌的抑制能力最强的防腐剂复配组合为12号和14号，即山梨酸钾与双乙酸钠复配比例为50∶50和75∶25；对志贺氏菌的抑制能力最强的防腐剂复配组合为12号和11号，即为山梨酸钾与双乙酸钠复配比例为50∶50和山梨酸钾∶双乙酸钠∶脱氢乙酸钠为50∶25∶25；对金黄色葡萄球菌的抑制能力最强的防腐剂复配组合为13号，即山梨酸钾与脱氢乙酸钠复配比例为75∶25。3种致病菌最佳防腐剂组合的抑菌性均随着浓度的减小而降低，但并不是呈线性比例降低；防腐剂复配组合的稀释比例为原来的70%、60%和50%时，对3种致病菌的抑制效果均不存在显著差异。

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Comparison of antibacterial effect of compound preservatives against pathogenic bacteria

(.*)

(1.AgriculturalCollegeofYanbianUniversity,YanjiJilin133002,China; 2.InstituteofAgro-productsProcessingScienceandTechnology,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100193,China)

Abstract：In order to reduce the amount of preservatives and achieve the desired preservative effects, three kinds of commercial preservatives potassium sorbate, sodium diacetate and sodium dehydroacetate were selected and mixed, the inhibitory effects on gram negative (G-) bacteria Salmonella enteritidis, Shigella castellani and gram positive (G+) bacteria Staphylococcus aureus were tested by enzyme-linked turbidimetry method. And the optimal compound preservatives were diluted into gradient concentrations and evaluated their inhibitory effects. The results showed that the strongest inhibitory ability for mixed proportion of potassium sorbate and sodium diacetate against S. enteritidis was 50∶50 and 75∶25. The best mixed proportion of potassium sorbate and sodium dehydroacetate against S. castellani was 50∶50 and potassium sorbate, sodium diacetate, sodium dehydroacetate against S. castellani was 50∶25∶25. The best mixed proportion of potassium sorbate and sodium dehydroacetate was 75∶25 against S. aureus. The proportion of 50∶25∶25 for potassium sorbate, sodium diacetate, sodium dehydroacetate showed the strongest inhibitory effect against three used pathogenic bacteria. With the concentrations of above three compound groups decreasing, the antibacterial abilities became weak, but did not show a linear relationship, there was no significant different when the concentration was diluted from 70% to 50%. It is concluded that the compound preservatives show better inhibitory ability, and the inhibitory ability is stable at a certain range of concentrations.

Key words:compound; preservative; antibacterial effect

中图分类号：TS.202.3

文献标识码：A

文章编号：1004-7999(2016)01-0018-06

DOI:10.13478/j.cnki.jasyu.2016.01.004

作者简介：陈雪(1991—)，女，吉林通化人，在读硕士，研究方向为作物安全生产与农产品质量。崔承弼为通信作者，E-mail：meixugao@263.net

收稿日期：2016-03-10基金项目：“十二五”国家科技支撑项目(2014BAA03B05)