外周血免疫炎症因子对肝细胞肝癌预后预测作用的评价

袁　林，沈世强，卢　欣

(1.广西柳州市人民医院普通外科,柳州545006；2.武汉大学人民医院普通外科,武汉430030)



外周血免疫炎症因子对肝细胞肝癌预后预测作用的评价

袁林1，沈世强2，卢欣1

(1.广西柳州市人民医院普通外科,柳州545006；2.武汉大学人民医院普通外科,武汉430030)

【摘要】目的探讨肝癌患者手术前后及确认复发时免疫炎症因子的表达及其临床意义，并监测其在复发中的价值。方法检测2007年9月～2015年6月间201例肝部分切除肝癌患者手术前后及70例健康体检者肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和高敏C-反应蛋白(hs-CRP)的水平，分析术前TNF-α和hs-CRP水平与临床病理特征的关系，并对手术后复发的102例肝癌患者的TNF-α和hs-CRP水平进行回顾性分析。同时检测可溶性E-钙黏蛋白(sEC)和甲胎蛋白(AFP)进行对比分析。结果肝细胞癌患者术前TNF-α、hs-CRP和sEC水平显著高于健康体检者，手术1周后TNF-α、hs-CRP和sEC水平较术前显著下降(P<0.01)。术前TNF-α、hs-CRP和sEC水平与肝细胞癌分级、TNM分期、有无门静脉癌栓、有无包膜相关(P<0.05或0.01)，TNF-α、hs-CRP与肿瘤大小相关(P<0.05)，sEC与肿瘤大小无关(P>0.05)。当确诊为肝癌复发时，TNF-α、hs-CRP、AFP和sEC水平明显高于术后水平(P<0.01)，但TNF-α、hs-CRP术后再次升高的时间明显早于sEC。结论术前肝细胞癌外周血免疫炎症因子TNF-α、hs-CRP 和sEC水平与临床分期有关，可作为一种肝细胞癌预后和复发的预测因子。TNF-α更侧重于肝癌时机体全身状态，而hs-CRP和sEC更侧重于癌组织局部生物学状态。

【关键词】肿瘤坏死因子α；高敏C-反应蛋白；可溶性E-钙黏蛋白；肝细胞癌；手术；复发

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是危害人类健康的常见消化道恶性肿瘤之一，在全球癌症病死率中已上升至第3位[1]。而近年来统计发现，每年我国肝癌病人死亡人数约占全球因肝癌死亡人数的53%[2]。目前，虽然肝癌根治切除术后的10年生存率已提高到30%左右，但即便是小肝癌根治性切除，5年内患者出现转移复发的概率仍高达70%左右[3]。因而探索肝癌术后转移复发的预测因子，尤其是寻找早期肝癌的预后因子是近年来国内外专家关注的热点。有研究显示：恶性肿瘤的发生发展与炎症反应密切关系，而且肝癌的病理起源与肝细胞持续存在的HBV病毒等感染并诱发慢性炎症反应有关。尽管已经有不少研究证实肿瘤可以诱发机体的炎症反应[4]，但具体机制尚未探明。肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)和高敏C-反应蛋白(high-sensitive C-reactive protein，hs-CRP)是重要的炎症反应的细胞因子，且TNF-α活化的NFκB和ROS可引起上皮细胞-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)，其中 E-钙黏蛋白(E-cadherin)的下调似乎是关键事件。我们的前期研究发现[5]，肝癌术前血清可溶性E-钙黏蛋白(Soluble E-cadherin，sEC)水平与临床分期有关，当确诊为肝癌复发时，sEC水平明显升高。本研究拟进一步验证早期肝癌患者sEC与外周血免疫炎症因子TNF-α和hs-CRP对预测早期肝癌患者术后预后的效果。

1资料与方法

1.1一般资料监测对象取自2007年9月～2015年6月间在本院行肝细胞癌根治切除术的患者235例，其中34例患者接受姑息性手术或者术后因并发症死亡或者恢复期临床症状未改善或者数据不完整而剔除，最终入组患者201例，男109例，女92例，年龄27～78岁，平均51.2岁。同时收集同期70例健康体检者作为对照，男41例，女29例，年龄25～64岁，平均47.1岁。健康体检者血细胞计数、血脂、肝肾功能均在正常范围。肝癌的诊断以UICC[6]为标准，所有研究对象均为初治病例，术前均未接受过任何药物治疗或放疗。手术患者术后定期随访，第1年每月1次，第2年后每2个月1次，检查内容包括TNF-α、hs-CRP、甲胎蛋白(AFP)、sEC、肝功能及影像学检查(肝脏B超、CT、MRI或血管造影等)，当AFP或sEC水平异常增高时，随访则改为每月1次。随访采用门诊复查、电话及书信等方式进行。随访截至2015年10月30日，随访时间为3～97个月，中位随访时间为55.2个月。其中有29例患者失访。最后确诊为HCC术后复发的患者102例，其中男59例，女43例，年龄25～66岁，平均48岁。复发时，AFP阳性(≥100 ng/ml)69例，AFP阴性(<20 ng/ml)33例；复发肿瘤与原发灶位于同侧半肝内46例，位于对侧半肝或全肝受累38例，位于同一肝段内18例；合并远处转移42例。复发肿瘤单个或多个结节相加直径为1.3～6.3 cm，平均2.9 cm；复发时间4～58个月，平均13.9个月。

1.2血清样本收集与处理患者手术前与手术后第7～9天，空腹8～12 h后于清晨取肘静脉血立即放入4℃冰箱静置20 min，4℃ 4000 r/min离心15 min分离血清，将血清转移到新的离心管中，放入-80℃冰箱保存。检测前取出血清样品，冰上融化后，4℃ 12 000 r/min离心10 min，除去血清中的不溶物。sEC、TNF-α采用ELISA法检测，AFP采用放射免疫法测定，hs-CRP用透射免疫比浊法测定，所有操作严格按试剂盒说明进行。

2结果

2.1手术前后肝癌患者及健康者血清TNF-α、hs-CRP、sEC、AFP的比较201例肝癌患者术前各指标均高于手术后，手术前后比较差异有统计学意义(P<0.01)；术前各指标也高于健康对照组，两者比较差异有统计学意义(P<0.01)；而术后TNF-α、hs-CRP、sEC和AFP稍高于健康对照组，但两者比较无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.2肝癌患者确诊复发时血清TNF-α、hs-CRP、sEC、AFP的变化确诊复发的102例患者血清TNF-α、hs-CRP、sEC和AFP浓度明显高于术后和健康对照组(P<0.01)。见表1。其中38例术后复发的肝癌患者，术后监测AFP一直为阴性，影像学检查已经发现肝占位病变，而在影像学检查阳性结果前，TNF-α平均(1.31±0.22)个月、hs-CRP平均(1.67±0.43)个月、sEC平均(2.31±1.59)个月已明显增高，TNF-α、hs-CRP、sEC出现升高的时间与AFP阴性结果状态比较，差异有统计学意义(P<0.05或0.01)，其中TNF-α、hs-CRP出现异常的时间更早。

表1　健康者及肝癌患者手术前后TNF-α、hs-CRP、AFP和sEC值的变化

注:与术前比较，aP<0.01；与健康对照组比较，bP<0.01；与术后比较，cP<0.01。

2.3肝癌患者血清TNF-α、hs-CRP、sEC与AFP对术前肝癌诊断及术后肝癌复发诊断的相关性分析相关分析表明，肝癌术前血清TNF-α、hs-CRP、sEC水平与AFP均呈正相关(r值分别为0.862、0.645、0.856，P均<0.01)；肝细胞癌术后复发时血清TNF-α、hs-CRP、sEC水平与AFP也呈正相关(r值分别为0.736、0.583、0.724，P均<0.01)；而肝细胞癌术后血清TNF-α、hs-CRP、sEC水平与AFP无相关性(r值分别为0.132、0.143、0.128，P均>0.05)。

2.4肝癌患者术前血清TNF-α、hs-CRP、sEC、AFP与临床病理特征的关系结果显示肝癌患者术前外周血TNF-α、hs-CRP、sEC水平与肝癌临床分期及分级相关，差异有统计学意义(P<0.01)；同时TNF-α、hs-CRP与肿瘤大小、有无门静脉癌栓、有无包膜的差异也有显著性(P<0.05或0.01)；但与年龄和性别差异均无统计学意义(P>0.05)。术前血清sEC浓度在不同年龄、性别及肿瘤大小差异无统计学意义(P>0.05)。而术前AFP水平仅与肝癌TNM分期密切相关(P<0.01)，与年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤分级、有无门静脉癌栓、有无包膜等因素无相关性(P>0.05)。见表2。

3讨论

目前，随着对恶性肿瘤研究的深入，炎症与恶性肿瘤的关系越来越被学者们广泛关注[7]，临床研究显示，可能有约15%的恶性疾病包括恶性肿瘤常常伴随着炎症反应，其中长期的慢性炎症也是引起细胞恶性转化的主要病因。同时恶性肿瘤细胞的生长、侵袭邻近正常组织和肿瘤生长过程中发生坏死均会对周围组织及细胞造成不同程度的损伤，并释放相应的炎性介质导致炎症反应的发生，而炎症反应又会反过来促使或加强恶性肿瘤细胞的生长和侵袭，进而促进恶性肿瘤的进展，导致预后不良。因此可以大胆地推测，炎症反应可以预测恶性肿瘤的预后。

TNF-α是一种多肽类物质，主要由单核巨噬细胞产生，参与机体多种生理与免疫及炎症反应过程的重要介质。也有报道显示：CRP水平的升高预示着胃癌患者疾病的进展和较晚的分期，其为胃癌患者预后的独立危险因子[8]。CRP在正常人血液中含量极微，随着一些高灵敏度检测方法的出现，低水平的CRP亦可被检测出来，因此被称为hs-CRP。但有关外周血hs-CRP及TNF-α在肝癌中的研究少有报道。研究还显示：由TNF-α活化的 NFκB 和 ROS均可在某些细胞中引起EMT，导致恶性肿瘤细胞的侵袭，进而引起肿瘤的复发和转移。在发生EMT的过程中[3]，E-钙黏蛋白的下调或缺失被认为是关键性事件，但该种效应在原发性肝癌中尚未见相关报道。我们的前期研究发现[8]，原发性肝癌患者肝癌组织中E-钙黏蛋白表达缺失，且在外周血中检测sEC有利于原发性肝癌的早期诊断和术后复发的监测，与肿瘤组织标本相比，血清学指标具有简便、重复性好、便于随访等优点。虽然AFP作为肝癌辅助诊断指标的重要地位已被公认[9，10]，但仍有30%～40%的肝癌患者血清AFP呈阴性[11]。因此，对这类患者寻求敏感的血清诊断标志物具有重要的临床意义。

表2　原发性肝癌病理学参数与血清TNF-α、hs-CRP、sEC、AFP水平的关系

本研究对201例肝癌患者手术前、手术后和健康对照者血清TNF-α、hs-CRP分析发现，术前TNF-α、hs-CRP均高于手术后和健康者(P<0.01)；而术后TNF-α、hs-CRP稍高于健康者，但两者差异不显著。表明肝癌患者存在明显的炎症反应，而术后的微炎症状态可能与手术损伤后机体的反应有关，而肿瘤的炎症状态明显强于后者，也有可能这种强烈的微炎症状态是恶性肿瘤生长、侵袭和转移的原因。

我们在检测肝癌患者手术前后TNF-α、hs-CRP的基础上，同时检测血sEC和AFP的变化，并对它们在肝癌术前、术后复发中相关性进行分析，结果显示：术前sEC和AFP均高于手术后和健康者(P<0.01)；而术后sEC和AFP与健康者比较，差异无统计学意义。TNF-α、hs-CRP、sEC在术前及术后复发与血清AFP水平均呈正相关，表明肝癌患者术前存在与AFP升高相一致的TNF-α、hs-CRP、sEC异常表达，术前监测TNF-α、hs-CRP、sEC水平也可作为原发性肝癌的检测指标。因此我们大胆推测，TNF-α、hs-CRP和sEC可像AFP一样作为肝癌血清检测标志物。

进一步对肝癌患者术前TNF-α、hs-CRP水平与肝癌患者临床病理特征分析发现，术前TNF-α、hs-CRP与肝癌的临床分级呈显著相关性(P<0.01)，与有无门静脉癌栓、有无包膜也有统计学意义，但hs-CRP与肿瘤大小的相关性较TNF-α更为明显，可能是CRP直接由肝细胞产生，肿瘤大小对正常肝细胞的代谢直接影响的结果。术前TNF-α与有无腹水差异显著，而hs-CRP无显著性。由此推测，一方面，肝癌患者存在微炎症状态，可以将TNF-α、hs-CRP作为肝癌患者微炎症状态的监测指标，并将TNF-α、hs-CRP作为其预后的监测因子；另一方面，肝癌微炎症状态时，TNF-α更倾向于反映肝癌患者全身微炎症状态，而hs-CRP倾向于反映肝癌患者肝组织局部微炎症状态。

虽然已有研究发现，TNF-α可影响EMT，而E-cadherin下调在恶性肿瘤细胞EMT过程中可能起着关键性作用。但我们在本研究中进一步对原发性肝癌患者术前TNF-α、sEC水平与临床病理特征进行分析，TNF-α与肿瘤大小有相关性，而与有无腹水无相关，而术前sEC与有无腹水有相关性，而与肿瘤大小无相关性，二者在其余的临床特征表现出一致性。由此推测，在将TNF-α、sEC作为其预后的监测因子时，TNF-α更倾向于反映肝癌患者全身免疫状态，而sEC倾向于反映肝癌患者肝组织局部状态。但有关二者在肝癌发生发展及预后的分子生物学内在联系有待进一步研究。对确诊复发时患者血清TNF-α、hs-CRP、sEC、AFP变化分析发现，TNF-α、hs-CRP、sEC均能较好地预测肝癌的复发，且对术后AFP持续阴性，而影像学检查已提示复发的38例患者的血TNF-α、hs-CRP、sEC、AFP变化时间进行对比，结果显示在影像学检查阳性结果前TNF-α平均(1.31±0.22)个月、hs-CRP平均(1.67±0.43)个月、sEC平均(2.31±1.59)个月已明显增高，这些指标出现升高的时间与AFP阴性结果状态比较差异显著，其中TNF-α、hs-CRP出现异常的时间更早。表明TNF-α、hs-CRP、sEC可作为肝癌复发预测因子较AFP意义大，且TNF-α、hs-CRP较sEC能更早预测肝癌的复发，在原发性肝癌复发过程中，外周血免疫炎症因子的变化更早于肝癌细胞结构的变化，这与机体细胞基础代谢结构理论相一致。

总之，本研究认为肝癌患者存在全身和肝癌组织局部炎症反应，肝癌患者机体全身微炎症状态或许会导致机体免疫功能的失衡，有利于肿瘤的转移和进展；局部的微炎症状态可导致正常细胞的损伤，有利于恶性肿瘤细胞的生长和侵袭。肝癌复发时也存在上述机制，对肝癌患者全身免疫炎症状态和肝癌组织局部侵袭转移机制内在联系的分子生物学通路进行研究，是本课题后期工作的重点和难点。

参考文献

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(编辑：潘明志)

An evaluation of prediction value of immune inflammatory factor on prognosis in patients with hepatocellular carcinoma

YUANLin1,SHENShiqiang2,LUXin1

(1.DepartmentofGeneralSurgery,People’sHospitalofLiuzhou,Liuzhou545006,China; 2.DepartmentofGeneralSurgery,RenminHospitalofWuhanUniversity,Wuhan430030,China)

【Abstract】ObjectiveTo investigate expression of immune inflammatory factor and its clinical significance in patients with HCC (hepatocellular carcinoma) before and after operation, and at the time when they were confirmed for relapse. In addition, clinical significance of immune inflammatory factor in recurrence of HCC was monitored. MethodsThe levels of tumor necrosis factor-α(TNF-α) and high-sensitivity C-reactive protein(hs-CRP) in 201 HCC patients were tested by enzyme linked immunosorbent assay(ELISA) before and after operation as well as in 70 healthy controls from September, 2007 to June, 2015. And their correlation with clinical and pathological factors were analyzed. In addition, levels of TNF-αand hs-CRP of 102 patients who relapsed after operation were retrospectively analyzed. At the same time, serum soluble E-cadherin(sEC) and alpha-fetoprotein(AFP) were detected and compared.Results The levels of TNF-α, hs-CRP and sEC in HCC patients before operation were significantly higher than those in the healthy controls, but they declined significantly one week after operation(P<0.01)．The levels of TNF-α, hs-CRP and sEC before operation showed significant correlation with HCC grade, TNM staging, with portal vein embolus or not and with diolame or not(P<0.05 or 0.01). TNF-αand hs-CRP levels were closely related to tumor size(P<0.05), but sEC was not related with the tumor size(P>0.05). When patients were confirmed with recurrence of HCC, their TNF-α, hs-CRP, AFP and sEC levels were significantly higher than those after operation(P<0.01), but TNF-αand hs-CRP levels raised more earlier than sEC level. ConclusionThe levels of TNF-α, hs-CRP and sEC in HCC patients before operation are closely related with clinical stages, which may be a predictive factor for prognosis and recurrence of HCC. TNF-α places emphasis on general body state of HCC, but sEC on local biological state of carcinoma tissues.

【Key words】TNF-α; hs-CRP; sEC; HCC; operation; recurrence

(收稿日期：2015-12-15修回日期：2016-02-25)

中图分类号：R735.7

文献标识码：A

DOI:10.3969/j.issn.1003-1383.2016.01.004

作者简介：袁林，男，主任医师，医学硕士，主要从事肝癌的防治与研究。E-mail: yuanl135@sina.com

基金项目：广西壮族自治区卫生厅计划课题(Z2014433)；广西柳州市培养新世纪学术和技术带头人专项资金

资助项目(柳人〔2000〕56号)