毛细管电泳-电化学检测法测定淮山中8种必需氨基酸含量

胡月芳，黄志强，李金芳

(贺州学院　化学与生物工程学院，广西　贺州　542899)

毛细管电泳-电化学检测法测定淮山中8种必需氨基酸含量

胡月芳*，黄志强，李金芳

(贺州学院化学与生物工程学院，广西贺州542899)

摘要：将8种人体内必需氨基酸(苏氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、色氨酸)与邻苯二甲醛(OPA)发生衍生化反应，再采用毛细管电泳-电化学检测(CE-ED)方法对其含量进行测定。考察了衍生化时间、检测电位、运行缓冲液浓度和pH值、分离电压及进样时间等的影响。在优化条件下，8种氨基酸在12 min内实现了分离，线性范围为0.1～1 500 μg/L；检出限为0.01～0.05 μg/L，峰高的相对标准偏差(RSD)为1.3%～1.8%，迁移时间的RSD为0.6%～1.0%。该方法已用于淮山样品中8种必需氨基酸的测定，加标回收率为96.8%～102.0%，RSD均不大于2.4%。

关键词：毛细管电泳；电化学检测；淮山；氨基酸

淮山别名山药、怀山药等，含有氨基酸(包括人体必需的8种氨基酸)、活性多糖、薯蓣皂苷、尿囊素、胆碱、黄酮、淀粉等成分，是一种常用药材和较佳的保健食品[1]。氨基酸是构成蛋白质的基本单位，是化学、生物、医药、农业、食品等领域的重要物质[2-3]。随着人们对淮山营养成分认识的加深，测定淮山中氨基酸的含量，尤其是8种人体必需的氨基酸含量成为评定淮山营养价值的基本指标之一。

近年来，一般采用传统的液相色谱法或氨基酸分析仪分离氨基酸[4-6]，但色谱法在样品分离前需对色谱柱进行预处理或改性，色谱柱价格昂贵，分离效率不高，检测速度慢，操作较繁琐；氨基酸分析仪分析成本较高。毛细管电泳方法(CE)具有消耗样品少、分离效率高，无需昂贵的色谱柱与复杂的前处理等优点[7-10]；电化学检测(ED) 对于电活性物质具有较高的灵敏度和选择性，采用毛细管电泳-电化学检测(CE-ED)测定氨基酸含量的研究已有报道[11-12]，但对淮山中8种人体必需的氨基酸(苏氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、色氨酸)含量同时测定的研究尚未见报道。因大部分氨基酸无电化学活性、荧光发射及紫外吸收，通常使用衍生化方法使氨基酸在硫醇类化合物存在下与邻苯二甲醛(OPA) 发生反应，生成具有电化学活性的强荧光衍生物之后，采用电化学、紫外、荧光、色谱法检测[13-14]。本文先使所测氨基酸与OPA发生衍生反应，再采用CE-ED法测定贺州市平桂区沙田镇淮山中8种人体必需的氨基酸含量，为进一步研究贺州市平桂区所产淮山的品质，促进淮山资源的开发与利用提供了依据。

1实验部分

1.1仪器与试剂

毛细管电泳-电化学检测系统(CE-ED，如图1)为自组装[11]，包括可调高压电源(±30 kV)，CHI660D电化学工作站(北京华科普天科技有限公司)；石英毛细管长55 cm，内径25 μm(河北永年光导纤维厂)；三维定位调节器；三电极体系包括：工作电极(直径125 μm铜圆盘电极)，对电极(铂丝电极)，参比电极(Ag/AgCl电极)；0.22 μm的乙酸纤维素滤膜(上海新亚净化器件厂)。

图1　自组装 CE-ED 装置示意图

苏氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、色氨酸、邻苯二甲醛(OPA)、 硫醇试剂(Sigma公司)；淮山样品购于贺州市阳光市场(产于贺州市平桂区沙田镇)，其他试剂均为分析纯。

1.2标准溶液、样品溶液与衍生试剂的配制

标准溶液：苏氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、色氨酸标准储备液的质量浓度均为1.00 g/L，用二次蒸馏水配制，再用运行缓冲液稀释至所需浓度。

样品溶液：取新鲜淮山于60 ℃烘干4 h，用研钵研成细粉，准确称取5.0 g粉末，加入70%乙醇100 mL，在室温下浸泡24 h。离心过滤，滤渣用70%乙醇10 mL洗涤 2 次，最后用0.10 mol/L的硼砂-H3BO3缓冲溶液定容至250 mL。

衍生化试剂：取50 mg OPA、1 mL(1 mol/L) 硫醇试剂、1 mL甲醇、1.8 mL(0.2 mol/L) Na2CO3和 NaHCO3混合溶液，超声溶解，配制后立即进行反应。

1.3衍生化反应原理

氨基酸与OPA衍生化反应原理[15]：OPA与硫醇试剂联用，碱性条件下(25 ℃)快速与一级氨基酸反应，生成强荧光且具有电化学活性的衍生物1-硫代-2-烷基-异吲哚，可采用电化学、紫外、荧光等法检测。

1.4实验方法

衍生化反应：在25 ℃温度下，取10 μL标准浓度氨基酸溶液，加入20 μL OPA 衍生化试剂，混匀30 s，静置50 s后进样。为了保证衍生反应的迅速和完全进行，OPA衍生剂采用过量加入，其加入量约为理论氨基酸含量的2倍。

毛细管用0.1 mol/L的NaOH、二次蒸馏水、缓冲液分别冲洗10,5,15 min后使用；铜圆盘电极用细砂纸打磨，用粒径0.3 μm的氧化铝粉末抛光平整，并于0～0.95 V(vs.Ag/AgCl)之间在NaOH溶液中扫描，进行电化学处理。采用自组装的CE-ED检测系统，调节工作电极与毛细管出口在同一直线上，最大程度靠近毛细管的末端，以0.10 mol/L的硼砂-H3BO3溶液为运行缓冲液，电动进样，检测池为阴极电泳槽。所有溶液使用前均用0.22 μm乙酸纤维素滤膜过滤。

2结果与讨论

2.1衍生化反应时间的选择

由于氨基酸与OPA反应生成衍生物的稳定性不高，信号减弱快，故衍生化反应时间必须严格控制。实验考察了衍生化时间在20～100 s之间时对8种氨基酸峰电流的影响。结果表明，衍生化时间过短，生成的衍生物的峰电流很低，信号很弱，检测困难，检出限不理想；而衍生化时间过长时，OPA试剂由透明变为微黄色，失去衍生功效，信号缓慢衰弱，也不能提高衍生物的稳定性。实验发现当衍生化时间为80 s时，衍生物的峰电流较稳定，电流值与检测灵敏度较高，故选择80 s为最佳衍生化时间。

2.2检测电位的选择

考察了不同检测电位对衍生化反应80 s后8种氨基酸峰高的影响。结果显示，在0.55～ 1.0 V 之间随着检测电位的增加，8种物质的峰高不断增高，且在0.85 V前增高较快，检出限减低明显；0.85 V之后峰高缓慢增高，检出限变化不大。实验也表明，随着检测电位的增大，本底电流和噪音均增加，当检测电位高于0.85 V 时，基线很不稳定，噪音较大，检测灵敏度下降。综合考虑灵敏度及稳定性等因素，选择0.85 V为最佳检测电位。

图2　缓冲溶液浓度对8个标准物迁移时间的影响Fig.2　Effect of buffer concentration on migration time of 0.5 mg/L eight standards

2.3运行缓冲溶液浓度与pH值的选择

实验验证了硼砂-H3BO3电泳缓冲体系的基线较平稳，检测灵敏度较Tris-H3BO3高，故选择硼砂-H3BO3作为运行缓冲溶液。考察了不同浓度的硼砂-H3BO3溶液对分离效果的影响。如图2所示，缓冲溶液浓度较低时，电泳电流低，8种氨基酸因迁移时间较短未能得到较好的基线分离；浓度太高时，分离时间随迁移时间的延长而增加，使检测变得耗时，且电泳电流增大导致基线噪音增大，从而降低检测的灵敏度与峰高。综合考虑，选择0.10 mol/L的硼砂-H3BO3为最优运行缓冲溶液。

固定硼砂-H3BO3缓冲液浓度为0.10 mol/L，考察了其pH值在7.5～ 10.0范围内对分离检测效果的影响。结果表明，当pH值小于8.0时，8种氨基酸不能实现基线分离，随着pH值的增加，8种氨基酸的迁移时间增长，分离效果提高，但峰形变宽，噪音增大，检测时间变长，检测灵敏度有所降低。综合考虑8种氨基酸的分离效果、检测时间和检测灵敏度，选择硼砂-H3BO3溶液的最佳pH值为8.0。

2.4分离电压与进样时间的选择

考察了分离电压在13～ 23 kV范围内对分离检测的影响。结果表明，分离电压太低会使迁移时间变长，检测时间变长，电泳峰形变宽，出现电泳峰重叠现象；随着分离电压的升高，则迁移时间逐渐缩短，可较快检出分析物，但过高的分离电压会使分离效果降低。因此，综合考虑各物质的分离度、灵敏度、检测时间及焦耳热等对分离检测的影响，选择17 kV为最优分离电压。

在选定最优运行缓冲溶液浓度、pH值和分离电压条件下，考察了不同进样时间对峰高的影响。实验结果显示，峰高随着进样时间的增长而增高，检出限降低。但进样时间超过8 s后峰高增加不明显，且电泳峰展宽，峰形拖尾，各分析物的分离效果降低，重现性差。综合考虑，选择8 s为最佳进样时间。

2.5重复性、线性范围与检出限

配制一系列不同浓度的8种氨基酸混合标准溶液，在最优条件下进行分离检测，8种氨基酸的浓度分别在一定范围内与电泳峰电流呈线性关系，线性范围、回归方程、相关系数及检出限如表1所示。以0.5 mg/L 的8种氨基酸混合标准溶液连续进样6次，电泳图如图3A所示。峰高的相对标准偏差(RSD)为1.3%～1.8%，迁移时间的RSD为0.6%～1.0%，表明方法的重复性良好。为了进一步验证该方法的优势，将本方法的检测结果与其他方法进行比较，相关数据表明，本方法的灵敏度较高，检出限较低(见表2)。

ComponentLinearrange(μg/L)Regressionequation*(mg/L)rDetectionlimit(μg/L)Threonine0.1～1000y=4.578x+8.9670.99970.04Taline0.2～1200y=3.872x+5.0230.99960.05Methionine0.1～1300y=3.437x+2.7540.99980.03Isoleucine0.5～1500y=3.691x+2.8730.99970.01Leucine0.3～1200y=4.884x+9.8910.99950.01Phenylalanine0.4～1200y=3.975x+5.8170.99980.02Lysine0.1～1200y=3.878x+4.9870.99960.04Tryptophan0.2～1400y=3.789x+4.1870.99980.02

*x:analyte concentration;y:peak current

表2　本实验方法与其他方法检测结果的比较

* not specified

2.6样品测定与回收率

取淮山样品超声提取液100 μL，添加衍生化试剂OPA 20 μL，并进行80 s衍生化反应，加硼砂-H3BO3溶液定容至1.00 mL，摇匀,进样检测淮山中8种必需氨基酸的含量，电泳图如图3B。与标准溶液的电泳图相比，1，2，3，4，5，6，7，8，x峰分别为苏氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、色氨酸和未知物的电流峰，表明8种必需氨基酸可在12 min 内实现基线分离，且分离效果良好。8种必需氨基酸的含量见表3，结果与文献[16]相当。

为再次验证CE-ED方法的可靠性，在淮山提取液中添加0.500 mg/g 8种必需氨基酸标准溶液进行加标回收率实验，重复6次对样品进行检测，结果见表3。实验结果表明，8种必需氨基酸的加标回收率为96.8%～102.0%，相对标准偏差(RSD)均不大于2.4%，由此可见用CE-ED方法检测淮山中氨基酸含量准确、重现性好，可成为淮山中氨基酸分析的可行方法。

表3　淮山中8种氨基酸的含量及加标回收率(n=6)

3结论

本文以邻苯二甲醛(OPA)为衍生剂与氨基酸发生衍生化反应，采用CE-ED 法检测淮山中8种必需氨基酸的含量。结果表明，在优化条件下，8种氨基酸在12 min内实现基线分离，被测物浓度与峰电流呈良好的线性关系。该方法简单可靠、准确、灵敏度高、重现性好，为淮山中氨基酸的测定提供了一种有效方法。淮山中8种氨基酸含量的测定结果也表明，淮山具有较高的营养价值，有良好的开发前景。

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Determination of Eight Essential Amino-acid in Yam by Capillary Electrophoresis with Electrochemical Detection

HU Yue-fang*,HUANG Zhi-qiang,LI Jin-fang

(College of Chemistry and Bioengineering，Hezhou University，Hezhou542899，China)

Abstract：After the derivatization reaction of 8 kinds of essential amino acids(threonine,valine,methionine,isoleucine,leucine,phenylalanine,lysine,tryptophan) in human body with o-phthalaldehyde(OPA),a method of capillary electrophoresis coupled with electrochemical detection(CE-ED) was established for the determination of these eight essential amino-acids.Effects of derivatization time,detection potential,concentration and pH value of running buffer,separation voltage and injection time on the detection were investigated.Under the optimum conditions,a good baseline separation and highly sensitive detection for eight essential amino-acid in yam were achieved in 12 min.The calibration curves of eight essential amino acids were linear in the range of 0.1-1 500 μg/L,with detection limits(S/N=3) of 0.01-0.05 μg/L.The relative standard deviations(RSDs) for peak heights of eight essential amino-acids were in the range of 1.3%-1.8%,and the RSDs for migration times were 0.6%-1.0%.The method was successfully applied in the assay of eight essential amino-acids in samples of yam,with spiked recoveries of 96.8%-102.0% and RSDs not more than 2.4%.

Key words：capillary electrophoresis;electrochemical detection;yam;amino-acid

收稿日期：2015-10-12；修回日期：2015-11-05

基金项目：广西高校科学技术研究赞助项目(2013YB238)；贺州市科学研究与技术开发计划项目(贺科转1408035)

*通讯作者：胡月芳，硕士，副教授，研究方向：电化学分析，Tel:0774-5271906，E-mail:huyuefang@126.com

doi:10.3969/j.issn.1004-4957.2016.04.017

中图分类号：O657.8；O629.7

文献标识码:A

文章编号：1004-4957(2016)04-0471-05