贵州小型猪血压及靶器官损害评价*

韦舒杰 何科成 杨永健 张彦 王强 李德 杨大春

贵州小型猪血压及靶器官损害评价*

韦舒杰 何科成 杨永健 张彦 王强 李德 杨大春

(成都军区总医院心血管内科， 四川 成都 610083)

目的 发现并评价一种新的高血压小型猪模型，并对其相关靶器官损害情况进行分析。方法 监测6、12、18个月龄贵州小型猪(n=5)动脉血压水平，并将其与同月龄家猪(n=5)作对比，测量18月龄时两组随机血糖(GLU)、糖化血红蛋白(HbA1c)、总胆固醇(TC)、甘油三脂(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL)、肌酐(Scr)、尿素氮水平(BUN)，ELISA法测量其血清肾上腺素(Epinephrine,E)、去甲肾上腺素(Norepinephrine,NE)、多巴胺(Dopamine,DA)及 尿香草扁桃酸(Vanilmandelic acid,VMA)水平，放射免疫法测定肾素(Renin)活性、血管紧张素Ⅰ(AngiotensineⅠ)、血管紧张素Ⅱ(AngiotensineⅡ)、醛固酮(Aldosterone)水平，左心室游离壁及肾皮质取材并进行H&E、MASSON染色。结果 与6、12、18同月龄家猪比较，贵州小型猪动脉收缩压及舒张压明显升高(P<0.01)；18个月龄时贵州小型猪血清TC[(3.11±0.09)mmol/L、TG[(0.62±0.04)mmol/L]、LDL[(1.81±0.05)mmol/L]水平显著高于家猪(均P<0.05)，而GLU、HbA1c、Scr及BUN水平则无明显差异(均P>0.05)；贵州小型猪血清E、NE、DA及尿VMA水平分别为[(6968.68±426.10)pg/ml]、[(20.21±0.91)ng/ml]、[(27404.26±4257.96)pg/ml]和[(61.36±2.14)ng/ml]均显著高于家猪(均P<0.01)，而肾素、血管紧张素Ⅰ、血管紧张素Ⅱ、醛固酮水平则无明显差异(均P>0.05)；对其靶器官心脏及肾脏HE及Masson染色结果显示，贵州小型猪相对于家猪，左心室游离壁有明显心肌细胞肥大及少量心肌纤维化，心肌细胞横截面面积[(651.05±7.58) μm2]显著高于家猪(P<0.01)，且肾小球有萎缩及轻微纤维化表现。结论 近交系贵州小型猪可成为一种新的动脉高血压动物模型，其交感系统活性活跃，且心脏及肾脏均可形成类似高血压靶器官损害的特征。

小型猪；高血压；高血压靶器官损害

原发性高血压(essential hypertension)是心血管疾病的主要危险因素之一，无论是在发达地区还是发展中国家都是重要的公共卫生问题，而且它是一种复杂的多因素疾病，受到遗传和环境多重因素的影响[1, 2]。现阶段，已有多种实验性高血压动物模型被建立模拟人类高血压反应，最为人熟知的则是自发性高血压大鼠动物模型[3]。

自自发性高血压大鼠选育成功以来，因其发病机制、高血压心血管并发症等与人类相似，现已被广泛应用于高血压病的医学基础试验研究[4,5]。另也有不少建立小鼠或大鼠继发性实验性高血压模型用于高血压的机制研究[6,7]。然而以上均是以小型动物作为试验承载体，故缺乏能更好地模拟人类原发性高血压的大型动物模型，且在试验新型药物、医用设备装置以及临床前研究等方面的价值都略显不足。另一方面，实验狗和猴会更多面临动物保护、价格昂贵等问题，而小型猪作为大型动物有着同人类相似的解剖结构和生理特征等许多独特优势，多用于转化研究、手术模型、临床前毒物试验等[8]。本研究旨在发现提供一种新的小型猪高血压模型，与普通家猪作为对比，检测其生理特征，并对其高血压相关靶器官损害情况进行分析评价。

1 材料和方法

1.1 实验动物及血压测量 贵州小型猪及家猪各5只，于1.5月龄时由成都达硕实验动物有限公司提供，雌雄不限。动物实验经过成都军区总医院动物管理委员会批准。于意识清醒、静息状态下测量家猪及贵州小型猪(n=5)在6、12、18月龄时的尾动脉血压(BP-98E，北京软隆生物技术有限公司)，每只测量有效数据3次，取收缩压及舒张压的平均值。

1.2 检测指标 两组模型猪均于18月龄时前腔静脉穿刺取血，采用全自动生化分析仪(AU2700，日本奥林巴斯)测量其血清随机血糖(GLU)、糖化血红蛋白(HbA1c)、总胆固醇(TC)、甘油三脂(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL)、肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)水平。放射免疫法测定肾素(Renin)活性、血管紧张素Ⅰ(ANGⅠ)、血管紧张素Ⅱ(ANGⅡ)、醛固酮(Aldosterone)水平。

1.3 血清及尿样ELISA分析 前腔静脉穿刺采集的血样及膀胱穿刺采集的尿样经离心分离出血清和尿标本，ELISA法(Elabscience，中国武汉)分别测量血清肾上腺素 (E)、去甲肾上腺素(NE)、多巴胺(DA)及尿香草扁桃酸(VMA)水平。

1.4 病理染色 18月龄处死两组模型猪，对左心室游离壁及肾皮质取材，固定脱水后石蜡切片，并进行H&E以及MASSON染色。测量心肌细胞横截面面积：心肌组织H&E染色中，光镜下观察于心肌横断面选取细胞核位于中央的心肌细胞,细胞横径为经细胞核至细胞短轴边缘，细胞纵径为经细胞核至细胞长轴边缘，每张切片随机选取5个视野(×100)，每次计数40个细胞，通过Image-Pro Plus软件定标后测量细胞横截面面积，取平均值用于分析。

2 结果

2.1 两组间动脉血压比较 6、12、18月龄时贵州小型猪收缩压分别为[(161.00±1.98)mmHg]、[(174.80±6.74)mmHg]、[(178.80±2.67)mmHg]，舒张压分别为[(111.40±7.10)mmHg]、[(110.80±5.54)mmHg]、[(116.60±6.99 )mmHg]；同月龄家猪收缩压分别为[(133.20±8.94)mmHg]、[(133.80±4.5) mmHg]、[(141.20±2.63)mmHg]，舒张压分别为[(72.80±3.61)mmHg]、[(81.80±3.54)mmHg]、[(90.00±2.57)mmHg]，贵州小型猪收缩压及舒张压均显著高于同月龄家猪，差异均有统计学意义(均P<0.05)，见图1。

图1 家猪与贵州小型猪动脉血压比较

Figure 1 The comparison of arterial pressure between the domestic pigs and Guizhou mini-pigs

注：A为动脉收缩压，B为动脉舒张压

2.2 两组间生理指标比较 18月龄时贵州小型猪血清TC、TG、LDL水平显著高于家猪，组间差异均有统计学意义(均P<0.05)；而GLU、HbA1c、Scr及BUN水平则无明显差异(均P>0.05)，见表1。

2.3 ELISA法及放射免疫法检测结果比较 18月龄时贵州小型猪血清E、NE、DA及尿VMA水平与同月龄家猪比较，差异均有统计学意义(均P<0.01)，提示贵州小型猪交感系统激素水平显著高于家猪；而RAAS系统Renin活性、ANGⅠ、ANGⅡ、醛固酮水平则无明显差异(均P>0.05)，见表2。

Tab 1 The comparison of blood parameters between Guizhou mini-pigs and domestic pigs

参数家猪贵州小型猪GLU(mmol/L)4.07±0.244.59±0.14HbA1c(×10-2)4.38±0.194.98±0.10TC(mmol/L)2.53±0.103.11±0.09①TG(mmol/L)0.24±0.030.62±0.04①LDL(mmol/L)1.24±0.051.81±0.05①HDL(mmol/L)0.84±0.030.90±0.02Scr(μmol/L)59.22±3.1158.98±1.50BUN(mmol/L)3.28±0.463.73±0.28

注：与家猪相比，①P<0.05

Tab 2 The comparison of related hormone levels between Guizhou mini-pigs and domestic pigs

参数 家猪贵州小型猪E(pg/ml)910.10±46.176968.68±426.10①NE(ng/ml)3.23±0.1320.21±0.91①DA(pg/ml)842.77±27.7827404.26±4257.96①Renin(pg/ml)2380.38±147.752502.00±525.81ANGⅠ(pg/ml)3015.44±917.743592.49±968.65ANGⅡ(pg/ml)78.07±20.5866.08±14.12Aldosterone(pg/ml)131.71±8.44122.56±19.49VMA(ng/ml)31.75±0.7761.36±2.14①

注：与家猪相比，①P<0.01

2.4 靶器官组织学分析 左心室游离壁H&E和MASSON染色结果显示，18月龄时贵州小型猪相比家猪，心肌细胞横截面面积[(651.05±9.08)μm2]显著高于家猪[(453.50±7.58)μm2]，组间差异有统计学意义(P<0.01)，且有显著的心肌细胞肥大及少量的心肌纤维化；肾皮质H&E和MASSON染色结果显示，贵州小型猪出现轻微的肾小球萎缩及微量的纤维化，见图2、3。

图2 贵州小型猪与家猪心肌细胞横截面面积对比

Figure 2 The comparison of cardiomyocyte area between Guizhou mini-pigs and domestic pigs

注：与家猪相比，①P<0.01

3 讨论

高血压是一种多因子疾病，涉及到遗传和环境因素之间复杂的相互作用，而科学研究允许我们利用多种多样的技术方法剥离出一个或数个因素来创造高血压的动物模型供于高血压的机制研究[9]，比如转基因高血压动物[10, 11]、内分泌高血压动物[7, 12]、环境干扰型高血压动物[13, 14]等等，其中自发性高血压大鼠是唯一能模拟人类原发性高血压的动物模型[4]，然而转化研究通常以猪这一类的大动物为研究模型。猪一直以来以其解剖及生理上与人类心血管系统的类似，得到众多研究者的青睐，相比小动物有着得天独厚的优势，其中特别是小型猪,因其高度可用性而受到转化医学越来越多的选择。尽管当前的研究中不缺乏利用猪作为动物模型创造继发性高血压的资料[15, 16]，但本研究是首次报道描述动脉高血压小型猪模型。贵州小型猪建系于中国贵州，现已广泛用于转化医学的研究，我们选择与正常家猪进行比较，发现在6个月龄时贵州小型猪动脉血压升高，明显高于同月龄家猪，且随着月龄的增加，收缩压及舒张压呈现上升的趋势。对高血压相关靶器官损害情况进行分析，我们发现贵州小型猪心肌细胞肥大、心肌纤维化，肾小球有萎缩及纤维化的迹象，证实其动脉血压高值确实存在，且进一步造成了类似于人类高血压的并发症。进一步追查其诱发高血压的原因，对其生理指标和主要影响动脉血压的交感神经系统和肾素-血管紧张素-醛固酮系统进行检测后，发现其血脂的异常以及交感系统活性的亢进，这些证据都提示交感神经系统过度活跃参与并维持贵州小型猪的自发性高血压。贵州小型猪乃是由贵州香猪引进后经历实验动物化的开发和培育形成的小型猪品系，我们有理由推测其近交系的发展可能受到表观遗传学方面的影响，但遗憾的是，本研究暂时缺乏表观遗传学的进一步探寻。

图3 两组靶器官H&E和MASSON染色

Figure 3 The target organs of two groups were stained with H&E and Masson trichrome

注:A、B为心肌组织H&E染色，C、D为肾皮质H&E染色，E、F为心肌组织MASSON染色，G、H为肾皮质MASSON染色，箭头所指蓝色处为纤维素沉积区域

4 结论

本研究通过测量不同月龄近交系贵州小型猪动脉血压、测定交感神经系统相关激素水平以及对高血压靶器官的组织学分析，证实了贵州小型猪动脉高血压的存在和靶器官的损害，进一步提供了一种可能归因于交感系统亢进创新的高血压小型猪模型，为今后可用于转化医学探讨原发性高血压机制提供了更优秀的动物选择。

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《西部医学》2016年各期重点内容安排

期次重点内容期次重点内容期次重点内容期次重点内容1呼吸 感染4影像 介入7消化 普外10内分泌 血液2泌尿 男科5妇产 儿科8骨科 创伤11风湿免疫 病理3心内 心外6神内 神外9肿瘤 血管外12急诊与重症医学

注：请广大作者按各期重点内容至少提前6个月投送符合本刊要求的学术论文

(本刊编辑部)

Analysis of a novel mini-pig model of spontaneous hypertension and target organ damage

WEI Shujie,ZHANG Yan, YANG Yongjian,etal

(DepartmentofCardiology,ChengduMilitaryGeneralHospital,Chengdu610083,China)

Objective To establish and evaluate a novel model of hypertensive mini-pig, and analyze the related target organs damage. Methods The blood pressure (BP) of 6、12、18 months Guizhou mini-pigs(n=5) and domestic pigs(n=5) were measured. At the age of 18 months, The plasma glucose, hemoglobin A1c (HbA1c) and lipid profiles including triglycerides, total cholesterol, low-density lipoprotein (LDL) cholesterol and high-density lipoprotein (HDL) cholesterol of both groups were assessed. The plasma concentrations of epinephrine (E), norepinephrine (NE), dopamine and urine vanilmandelic acid (VMA) of the two groups were measured using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kits. The plasma renin activity and the plasma levels of angiotensin (ANG) Ⅰ, Ⅱ, and aldosterone were assayed by radioimmunoassay. The heart and kidney of two groups were stained with H&E, Masson trichrome. Results The BP of 6, 12, 18 months Guizhou mini-pigs are significantly higher than the same age domestic pigs(P<0.01). The serum TC(3.11±0.09)mmol/L、TG(0.62±0.04)mmol/L, LDL(1.81±0.05)mmol/L of the 18 months of Guizhou mini-pigs were higher than that of domestic pig (allP<0.05). Moreover, the serum E, NE, DA and urine VMA level of Guizhou mini-pigs were (6968.68±426.10) pg/ml, (20.21±0.91)ng/ml, (27404.26±4257.96)pg/ml and (61.36±2.14)ng/ml, which were significantly higher than domestic pigs(allP<0.01).The H&E and Masson trichrome stain results show that The mini-pigs demonstrated a significant cardiac hypertrophy and a slight fibrosis and mild renal fibrosis as compared with domestic pigs. Conclusion The Guizhou mini-pig is a novel hypertensive animal model with sympathetic hyperactivity.

Mini-pig； Hypertension； Target organ damage

国家自然科学基金(81070191、81500224)；全军医学科技青年培育项目(13QNP058)；成都军区总医院院管课题(2013YG-B073)

杨永健，博士后，主任医师，博士生导师，本刊常务编委，E-mail：yangyongjian38@sina.com

R 544.1

A

10.3969/j.issn.1672-3511.2016.03.009

2015-12-01； 修回日期： 2016-02-03; 编辑： 母存培)