盐酸小檗碱对大鼠主动脉内皮细胞增殖与凋亡的作用

梁宝今　蒙如庆　周卓东　梁涛

[摘要]目的 观察盐酸小檗碱对大鼠主动脉内皮细胞增殖与凋亡的作用，以探讨盐酸小檗碱促进内皮细胞凋亡的机制。方法25 umol/L、50 umol/L、75 umol/L、100 umol/L浓度小檗碱分别干预大鼠主动脉内皮细胞1 h、2 h、4h、8 h、12 h、24 h、48 h、72 h。MTr法检测细胞增殖活性，Western Blot方法检测促凋亡蛋白BAX的表达。结果 不同浓度盐酸小檗碱作用于大鼠主动脉内皮细胞可显著抑制其增殖（P<0.001）；盐酸小檗碱与大鼠主动脉内皮细胞作用24 h，促凋亡蛋白BAX随浓度增加而上调（P<0.001）。结论 盐酸小檗碱可抑制大鼠主动脉内皮细胞增殖，并上调促凋亡蛋白BAX水平。

[关键词]盐酸小檗碱；主动脉内皮细胞；增殖；凋亡

盐酸小檗碱亦称黄连素，是毛茛科黄连属植物黄连、黄柏的根茎中的主要成分，属于异喹啉类生物碱，临床上多用于抗肠道细菌感染。近年来小檗碱的研究越来越广泛，包括降糖、降脂、内皮依赖性舒张血管、诱导自噬、神经性疾病的治疗等方向。内皮细胞的凋亡即内皮细胞的程序性坏死，诱导内皮细胞凋亡可抑制血管新生导致血管退化。目前，通过抑制肿瘤血管新生治疗肿瘤的方式已成为新的研究方向。

1.材料与方法

1.1主要试剂与仪器 盐酸小檗碱（分子式：C20H18C1N04，分子量：371.81，CAS号：633-65-8）：阿拉丁试剂公司：大鼠主动脉内皮细胞株：清华大学医学实验室馈赠；PRMI.1640培养基：Gibico公司；噻唑兰（MrlT）：凯基生物试剂公司；胎牛血清：Hyclone公司；BAX：SANTA公司；beta-actin：ABJENT；HRP标记的羊抗兔抗体BCA试剂盒、RIPA裂解液、PMSF、PVDF膜：碧云天公司；二甲基亚砜（DMSO）：Sigma公司；全自动酶标仪Muhiskan MK3：Thermo公司；电泳槽、电泳仪、凝胶成像仪：BIO-RAD。

1.2实验方法

1.2.1大鼠主动脉内皮细胞的复苏、培养 将冻存于液氮的大鼠主动脉内皮细胞解冻、1000转/分离心3 min，并在含10%胎牛血清的PRMI-1640培养基中培养，置于37℃、5%CO2培养箱。当细胞长到80%左右，用0.25%胰酶（含EDTA）消化传代。在显微镜下观察细胞状态、形态，选取状态优良的细胞进行后续体外试验。

1.2.2MTT法检测盐酸小檗碱对大鼠主动脉内皮细胞增殖的影响 对消化的大鼠主动脉内皮细胞进行细胞计数，以1×104细胞/孔加入96孔板中，每孔200 uL，置于37℃、5%CO2培养箱中培养24 h。待细胞贴壁后加人不同浓度的盐酸小檗碱（0umol/L、25umol//L，50umol//L、75umol//L、100umol//L），每组6个复孔，培养1 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h、48 h、72 h。培养结束弃上清，避光加人M1Tr溶液（终浓度5 mg/m1），置于37℃、5%CO2培养箱继续培养4h，弃细胞上清液，每孔加入二甲基亚砜（DMSO）150uL，于恒温振荡箱反应10 min以充分溶解。在全自动酶标仪490 nm处测吸光度OD值。

1.2.3Western Blot检测BAX蛋白 25 umol/L、50umol//L、75umol//L、100umol//L浓度盐酸小檗碱处理大鼠主动脉内皮细胞24 h后.用100：1的RIPA/PMSF混合液提取各组细胞总蛋白，注意冰上操作，以减轻蛋白裂解；使用BCA试剂盒测定蛋白浓度，酶标仪562 nm处检测OD值，计算出蛋白的质量。每个样品加5xSDS 25uL，100℃沸水中变性。分别从每组中取总蛋白25ug制备蛋白上样，进行12%SDS-PAGE胶电泳，连接正负极，加满电泳液，开始使用80 V电压.跑30 min后把电压改为120 V.样本继续跑1 h，直到溴酚蓝跑出玻璃板。PVDF膜转膜，电泳槽置冰上，100 V电压跑75 min。丽春红染色并用去离子水清洗，配一抗、二抗稀释液（水：casein=20：1），抗体浓度为（1：1000），一抗4℃过夜，TBST洗膜3次，每次7 min，二抗室温孵育2 h，TBST洗膜3次，每次7 min，用碧云天ECL发光液进行发光，通过凝胶成像仪显影，并用imageJ进行灰度值分析。

1.3統计学方法 应用SPSS 13.0统计软件进行分析，计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，多个样本均数比较采用成组设计的单因素方差分析，3个样本均数两两比较的q检验（Newman-Keuls法），检验水准：a=0.05，双侧检验。

2.结果

2.1不同浓度小檗碱在不同干预时间作用下的OD值 使用25umol//L、50umol/L、75 umol/L、100umol/L浓度小檗碱分别干预大鼠主动脉内皮细胞1h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h、48 h、72 h。MTY法检测细胞增殖活性结果。由表1、图1可见，与对照组（0umol/L）相比，25umol//L、50 umol/L、75umol/L、100 umol/L浓度小檗碱作用8 h、12 h、24 h、48 h、72h时差异均有统计学意义（P<0.01），提示小檗碱对大鼠主动脉内皮细胞具有抑制增殖活性的作用。不同浓度作用12 h、24 h OD值变化较明显，且这两个时间点效果相似，故选取12 h作为最适作用时间。其中各浓度作用1 h、2 h，内皮细胞抑制率低于10%；4 h、8 h内皮细胞抑制率低于25%；12 h、24 h、48 h、72 h内皮细胞抑制率为31%-62%，其中72小时100umol/L小檗碱作用内皮细胞抑制率可达到62%。

2.2不同浓度盐酸小檗碱处理后BAX蛋白表达水平 不同浓度盐酸小檗碱处理大鼠主动脉内皮细胞24 h后，Western Blot结果如图2所示。可见25umol/L、50umol//L、75umol/L、100umol/L浓度小檗碱促进促凋亡蛋白BAX水平的表达.但是未见浓度依赖性。

3.讨论

3.1盐酸小檗碱可抑制大鼠主动脉内皮细胞增殖

细胞凋亡可抑制血管新生过程，导致血管退化。本研究主要以不同浓度的盐酸小檗碱作用于大鼠主动脉内皮细胞，观察其增殖活性及检测促凋亡蛋白BAx的表达.探讨盐酸小檗碱对内皮细胞凋亡的作用机制，为抑制血管新生过程的研究提供理论基础。使用25umol/L、50umol/L、75umol/L、100umol/L浓度小檗碱分别干预大鼠主动脉内皮细胞1 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h、48 h、72 h，可见12 h、24 h、48 h、72 h时差异均有统计学意义.提示小檗碱对大鼠主动脉内皮细胞具有抑制增殖活性的作用。但是，作用1 h、2 h、4 h疗效不显著，可能与药物在内皮细胞的代谢有关。血管内皮生长因子（VEGF）是肿瘤血管形成最关键的生長因子，研究表明，HIF-1A可以诱导VEGF的表达增加，并且可以引起肿瘤组织的微血管密度增加，在肿瘤新生血管形成过程中有着重要的作用。小檗碱不仅可以显著抑制肿瘤血管增殖，降低胞内ROS水平，而且在维生素E存在时可完全清除肿瘤诱导产生的新生血管，提示了小檗碱具有抑制肿瘤血管形成的特性。

3.2盐酸小檗碱可上调促凋亡蛋白BAX的表达不同浓度盐酸小檗碱处理大鼠主动脉内皮细胞24 h后，Western Blot检测结果可见25 umol/L、50 umo]/L、75 umol/L、100 umol/L浓度小檗碱促进促凋亡蛋白BAX水平的表达，但是未见浓度依赖性。内皮细胞的凋亡主要与肿瘤坏死因子死亡通路及线粒体途径通路有关。肿瘤坏死因子死亡通路主要包括天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶8（caspase8）和丝裂原激活蛋白激酶（P38MAPK）信号途径。肿瘤坏死因子有调节血管形成的作用.低剂量肿瘤坏死因子能促进内皮细胞形成血管结构：高剂量肿瘤坏死因子能诱导内皮细胞凋亡。BAX基因是BCL-2家族中最重要的一个促凋亡因子，通过BH3区域识别BCL-2蛋白并形成BAX-BCL-2异二聚体，发挥促凋亡作用。。游离BAX可直接在线粒体膜上形成BAX-BAX同二聚体，改变线粒体膜通透性.使细胞色素C释放到胞质，激活下游的caspase3协同细胞凋亡。

本实验发现不同浓度的盐酸小檗碱作用于大鼠主动脉内皮细胞，能抑制其增殖活性及上调促凋亡蛋白BAX的表达，高剂量小檗碱较低剂量小檗碱抑制增殖作用更明显。

梁宝今　蒙如庆　周卓东　梁涛

[摘要]目的 观察盐酸小檗碱对大鼠主动脉内皮细胞增殖与凋亡的作用，以探讨盐酸小檗碱促进内皮细胞凋亡的机制。方法25 umol/L、50 umol/L、75 umol/L、100 umol/L浓度小檗碱分别干预大鼠主动脉内皮细胞1 h、2 h、4h、8 h、12 h、24 h、48 h、72 h。MTr法检测细胞增殖活性，Western Blot方法检测促凋亡蛋白BAX的表达。结果 不同浓度盐酸小檗碱作用于大鼠主动脉内皮细胞可显著抑制其增殖（P<0.001）；盐酸小檗碱与大鼠主动脉内皮细胞作用24 h，促凋亡蛋白BAX随浓度增加而上调（P<0.001）。结论 盐酸小檗碱可抑制大鼠主动脉内皮细胞增殖，并上调促凋亡蛋白BAX水平。

[关键词]盐酸小檗碱；主动脉内皮细胞；增殖；凋亡

盐酸小檗碱亦称黄连素，是毛茛科黄连属植物黄连、黄柏的根茎中的主要成分，属于异喹啉类生物碱，临床上多用于抗肠道细菌感染。近年来小檗碱的研究越来越广泛，包括降糖、降脂、内皮依赖性舒张血管、诱导自噬、神经性疾病的治疗等方向。内皮细胞的凋亡即内皮细胞的程序性坏死，诱导内皮细胞凋亡可抑制血管新生导致血管退化。目前，通过抑制肿瘤血管新生治疗肿瘤的方式已成为新的研究方向。

1.材料与方法

1.1主要试剂与仪器 盐酸小檗碱（分子式：C20H18C1N04，分子量：371.81，CAS号：633-65-8）：阿拉丁试剂公司：大鼠主动脉内皮细胞株：清华大学医学实验室馈赠；PRMI.1640培养基：Gibico公司；噻唑兰（MrlT）：凯基生物试剂公司；胎牛血清：Hyclone公司；BAX：SANTA公司；beta-actin：ABJENT；HRP标记的羊抗兔抗体BCA试剂盒、RIPA裂解液、PMSF、PVDF膜：碧云天公司；二甲基亚砜（DMSO）：Sigma公司；全自动酶标仪Muhiskan MK3：Thermo公司；电泳槽、电泳仪、凝胶成像仪：BIO-RAD。

1.2实验方法

1.2.1大鼠主动脉内皮细胞的复苏、培养 将冻存于液氮的大鼠主动脉内皮细胞解冻、1000转/分离心3 min，并在含10%胎牛血清的PRMI-1640培养基中培养，置于37℃、5%CO2培养箱。当细胞长到80%左右，用0.25%胰酶（含EDTA）消化传代。在显微镜下观察细胞状态、形态，选取状态优良的细胞进行后续体外试验。

1.2.2MTT法检测盐酸小檗碱对大鼠主动脉内皮细胞增殖的影响 对消化的大鼠主动脉内皮细胞进行细胞计数，以1×104细胞/孔加入96孔板中，每孔200 uL，置于37℃、5%CO2培养箱中培养24 h。待细胞贴壁后加人不同浓度的盐酸小檗碱（0umol/L、25umol//L，50umol//L、75umol//L、100umol//L），每组6个复孔，培养1 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h、48 h、72 h。培养结束弃上清，避光加人M1Tr溶液（终浓度5 mg/m1），置于37℃、5%CO2培养箱继续培养4h，弃细胞上清液，每孔加入二甲基亚砜（DMSO）150uL，于恒温振荡箱反应10 min以充分溶解。在全自动酶标仪490 nm处测吸光度OD值。

1.2.3Western Blot检测BAX蛋白 25 umol/L、50umol//L、75umol//L、100umol//L浓度盐酸小檗碱处理大鼠主动脉内皮细胞24 h后.用100：1的RIPA/PMSF混合液提取各组细胞总蛋白，注意冰上操作，以减轻蛋白裂解；使用BCA试剂盒测定蛋白浓度，酶标仪562 nm处检测OD值，计算出蛋白的质量。每个样品加5xSDS 25uL，100℃沸水中变性。分别从每组中取总蛋白25ug制备蛋白上样，进行12%SDS-PAGE胶电泳，连接正负极，加满电泳液，开始使用80 V电压.跑30 min后把电压改为120 V.样本继续跑1 h，直到溴酚蓝跑出玻璃板。PVDF膜转膜，电泳槽置冰上，100 V电压跑75 min。丽春红染色并用去离子水清洗，配一抗、二抗稀释液（水：casein=20：1），抗体浓度为（1：1000），一抗4℃过夜，TBST洗膜3次，每次7 min，二抗室温孵育2 h，TBST洗膜3次，每次7 min，用碧云天ECL发光液进行发光，通过凝胶成像仪显影，并用imageJ进行灰度值分析。

1.3統计学方法 应用SPSS 13.0统计软件进行分析，计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，多个样本均数比较采用成组设计的单因素方差分析，3个样本均数两两比较的q检验（Newman-Keuls法），检验水准：a=0.05，双侧检验。

2.结果

2.1不同浓度小檗碱在不同干预时间作用下的OD值 使用25umol//L、50umol/L、75 umol/L、100umol/L浓度小檗碱分别干预大鼠主动脉内皮细胞1h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h、48 h、72 h。MTY法检测细胞增殖活性结果。由表1、图1可见，与对照组（0umol/L）相比，25umol//L、50 umol/L、75umol/L、100 umol/L浓度小檗碱作用8 h、12 h、24 h、48 h、72h时差异均有统计学意义（P<0.01），提示小檗碱对大鼠主动脉内皮细胞具有抑制增殖活性的作用。不同浓度作用12 h、24 h OD值变化较明显，且这两个时间点效果相似，故选取12 h作为最适作用时间。其中各浓度作用1 h、2 h，内皮细胞抑制率低于10%；4 h、8 h内皮细胞抑制率低于25%；12 h、24 h、48 h、72 h内皮细胞抑制率为31%-62%，其中72小时100umol/L小檗碱作用内皮细胞抑制率可达到62%。

2.2不同浓度盐酸小檗碱处理后BAX蛋白表达水平 不同浓度盐酸小檗碱处理大鼠主动脉内皮细胞24 h后，Western Blot结果如图2所示。可见25umol/L、50umol//L、75umol/L、100umol/L浓度小檗碱促进促凋亡蛋白BAX水平的表达.但是未见浓度依赖性。

3.讨论

3.1盐酸小檗碱可抑制大鼠主动脉内皮细胞增殖

细胞凋亡可抑制血管新生过程，导致血管退化。本研究主要以不同浓度的盐酸小檗碱作用于大鼠主动脉内皮细胞，观察其增殖活性及检测促凋亡蛋白BAx的表达.探讨盐酸小檗碱对内皮细胞凋亡的作用机制，为抑制血管新生过程的研究提供理论基础。使用25umol/L、50umol/L、75umol/L、100umol/L浓度小檗碱分别干预大鼠主动脉内皮细胞1 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h、48 h、72 h，可见12 h、24 h、48 h、72 h时差异均有统计学意义.提示小檗碱对大鼠主动脉内皮细胞具有抑制增殖活性的作用。但是，作用1 h、2 h、4 h疗效不显著，可能与药物在内皮细胞的代谢有关。血管内皮生长因子（VEGF）是肿瘤血管形成最关键的生長因子，研究表明，HIF-1A可以诱导VEGF的表达增加，并且可以引起肿瘤组织的微血管密度增加，在肿瘤新生血管形成过程中有着重要的作用。小檗碱不仅可以显著抑制肿瘤血管增殖，降低胞内ROS水平，而且在维生素E存在时可完全清除肿瘤诱导产生的新生血管，提示了小檗碱具有抑制肿瘤血管形成的特性。

3.2盐酸小檗碱可上调促凋亡蛋白BAX的表达不同浓度盐酸小檗碱处理大鼠主动脉内皮细胞24 h后，Western Blot检测结果可见25 umol/L、50 umo]/L、75 umol/L、100 umol/L浓度小檗碱促进促凋亡蛋白BAX水平的表达，但是未见浓度依赖性。内皮细胞的凋亡主要与肿瘤坏死因子死亡通路及线粒体途径通路有关。肿瘤坏死因子死亡通路主要包括天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶8（caspase8）和丝裂原激活蛋白激酶（P38MAPK）信号途径。肿瘤坏死因子有调节血管形成的作用.低剂量肿瘤坏死因子能促进内皮细胞形成血管结构：高剂量肿瘤坏死因子能诱导内皮细胞凋亡。BAX基因是BCL-2家族中最重要的一个促凋亡因子，通过BH3区域识别BCL-2蛋白并形成BAX-BCL-2异二聚体，发挥促凋亡作用。。游离BAX可直接在线粒体膜上形成BAX-BAX同二聚体，改变线粒体膜通透性.使细胞色素C释放到胞质，激活下游的caspase3协同细胞凋亡。

本实验发现不同浓度的盐酸小檗碱作用于大鼠主动脉内皮细胞，能抑制其增殖活性及上调促凋亡蛋白BAX的表达，高剂量小檗碱较低剂量小檗碱抑制增殖作用更明显。

梁宝今　蒙如庆　周卓东　梁涛

[摘要]目的 观察盐酸小檗碱对大鼠主动脉内皮细胞增殖与凋亡的作用，以探讨盐酸小檗碱促进内皮细胞凋亡的机制。方法25 umol/L、50 umol/L、75 umol/L、100 umol/L浓度小檗碱分别干预大鼠主动脉内皮细胞1 h、2 h、4h、8 h、12 h、24 h、48 h、72 h。MTr法检测细胞增殖活性，Western Blot方法检测促凋亡蛋白BAX的表达。结果 不同浓度盐酸小檗碱作用于大鼠主动脉内皮细胞可显著抑制其增殖（P<0.001）；盐酸小檗碱与大鼠主动脉内皮细胞作用24 h，促凋亡蛋白BAX随浓度增加而上调（P<0.001）。结论 盐酸小檗碱可抑制大鼠主动脉内皮细胞增殖，并上调促凋亡蛋白BAX水平。

[关键词]盐酸小檗碱；主动脉内皮细胞；增殖；凋亡

盐酸小檗碱亦称黄连素，是毛茛科黄连属植物黄连、黄柏的根茎中的主要成分，属于异喹啉类生物碱，临床上多用于抗肠道细菌感染。近年来小檗碱的研究越来越广泛，包括降糖、降脂、内皮依赖性舒张血管、诱导自噬、神经性疾病的治疗等方向。内皮细胞的凋亡即内皮细胞的程序性坏死，诱导内皮细胞凋亡可抑制血管新生导致血管退化。目前，通过抑制肿瘤血管新生治疗肿瘤的方式已成为新的研究方向。

1.材料与方法

1.1主要试剂与仪器 盐酸小檗碱（分子式：C20H18C1N04，分子量：371.81，CAS号：633-65-8）：阿拉丁试剂公司：大鼠主动脉内皮细胞株：清华大学医学实验室馈赠；PRMI.1640培养基：Gibico公司；噻唑兰（MrlT）：凯基生物试剂公司；胎牛血清：Hyclone公司；BAX：SANTA公司；beta-actin：ABJENT；HRP标记的羊抗兔抗体BCA试剂盒、RIPA裂解液、PMSF、PVDF膜：碧云天公司；二甲基亚砜（DMSO）：Sigma公司；全自动酶标仪Muhiskan MK3：Thermo公司；电泳槽、电泳仪、凝胶成像仪：BIO-RAD。

1.2实验方法

1.2.1大鼠主动脉内皮细胞的复苏、培养 将冻存于液氮的大鼠主动脉内皮细胞解冻、1000转/分离心3 min，并在含10%胎牛血清的PRMI-1640培养基中培养，置于37℃、5%CO2培养箱。当细胞长到80%左右，用0.25%胰酶（含EDTA）消化传代。在显微镜下观察细胞状态、形态，选取状态优良的细胞进行后续体外试验。

1.2.2MTT法检测盐酸小檗碱对大鼠主动脉内皮细胞增殖的影响 对消化的大鼠主动脉内皮细胞进行细胞计数，以1×104细胞/孔加入96孔板中，每孔200 uL，置于37℃、5%CO2培养箱中培养24 h。待细胞贴壁后加人不同浓度的盐酸小檗碱（0umol/L、25umol//L，50umol//L、75umol//L、100umol//L），每组6个复孔，培养1 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h、48 h、72 h。培养结束弃上清，避光加人M1Tr溶液（终浓度5 mg/m1），置于37℃、5%CO2培养箱继续培养4h，弃细胞上清液，每孔加入二甲基亚砜（DMSO）150uL，于恒温振荡箱反应10 min以充分溶解。在全自动酶标仪490 nm处测吸光度OD值。

1.2.3Western Blot检测BAX蛋白 25 umol/L、50umol//L、75umol//L、100umol//L浓度盐酸小檗碱处理大鼠主动脉内皮细胞24 h后.用100：1的RIPA/PMSF混合液提取各组细胞总蛋白，注意冰上操作，以减轻蛋白裂解；使用BCA试剂盒测定蛋白浓度，酶标仪562 nm处检测OD值，计算出蛋白的质量。每个样品加5xSDS 25uL，100℃沸水中变性。分别从每组中取总蛋白25ug制备蛋白上样，进行12%SDS-PAGE胶电泳，连接正负极，加满电泳液，开始使用80 V电压.跑30 min后把电压改为120 V.样本继续跑1 h，直到溴酚蓝跑出玻璃板。PVDF膜转膜，电泳槽置冰上，100 V电压跑75 min。丽春红染色并用去离子水清洗，配一抗、二抗稀释液（水：casein=20：1），抗体浓度为（1：1000），一抗4℃过夜，TBST洗膜3次，每次7 min，二抗室温孵育2 h，TBST洗膜3次，每次7 min，用碧云天ECL发光液进行发光，通过凝胶成像仪显影，并用imageJ进行灰度值分析。

1.3統计学方法 应用SPSS 13.0统计软件进行分析，计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，多个样本均数比较采用成组设计的单因素方差分析，3个样本均数两两比较的q检验（Newman-Keuls法），检验水准：a=0.05，双侧检验。

2.结果

2.1不同浓度小檗碱在不同干预时间作用下的OD值 使用25umol//L、50umol/L、75 umol/L、100umol/L浓度小檗碱分别干预大鼠主动脉内皮细胞1h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h、48 h、72 h。MTY法检测细胞增殖活性结果。由表1、图1可见，与对照组（0umol/L）相比，25umol//L、50 umol/L、75umol/L、100 umol/L浓度小檗碱作用8 h、12 h、24 h、48 h、72h时差异均有统计学意义（P<0.01），提示小檗碱对大鼠主动脉内皮细胞具有抑制增殖活性的作用。不同浓度作用12 h、24 h OD值变化较明显，且这两个时间点效果相似，故选取12 h作为最适作用时间。其中各浓度作用1 h、2 h，内皮细胞抑制率低于10%；4 h、8 h内皮细胞抑制率低于25%；12 h、24 h、48 h、72 h内皮细胞抑制率为31%-62%，其中72小时100umol/L小檗碱作用内皮细胞抑制率可达到62%。

2.2不同浓度盐酸小檗碱处理后BAX蛋白表达水平 不同浓度盐酸小檗碱处理大鼠主动脉内皮细胞24 h后，Western Blot结果如图2所示。可见25umol/L、50umol//L、75umol/L、100umol/L浓度小檗碱促进促凋亡蛋白BAX水平的表达.但是未见浓度依赖性。

3.讨论

3.1盐酸小檗碱可抑制大鼠主动脉内皮细胞增殖

细胞凋亡可抑制血管新生过程，导致血管退化。本研究主要以不同浓度的盐酸小檗碱作用于大鼠主动脉内皮细胞，观察其增殖活性及检测促凋亡蛋白BAx的表达.探讨盐酸小檗碱对内皮细胞凋亡的作用机制，为抑制血管新生过程的研究提供理论基础。使用25umol/L、50umol/L、75umol/L、100umol/L浓度小檗碱分别干预大鼠主动脉内皮细胞1 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h、48 h、72 h，可见12 h、24 h、48 h、72 h时差异均有统计学意义.提示小檗碱对大鼠主动脉内皮细胞具有抑制增殖活性的作用。但是，作用1 h、2 h、4 h疗效不显著，可能与药物在内皮细胞的代谢有关。血管内皮生长因子（VEGF）是肿瘤血管形成最关键的生長因子，研究表明，HIF-1A可以诱导VEGF的表达增加，并且可以引起肿瘤组织的微血管密度增加，在肿瘤新生血管形成过程中有着重要的作用。小檗碱不仅可以显著抑制肿瘤血管增殖，降低胞内ROS水平，而且在维生素E存在时可完全清除肿瘤诱导产生的新生血管，提示了小檗碱具有抑制肿瘤血管形成的特性。

3.2盐酸小檗碱可上调促凋亡蛋白BAX的表达不同浓度盐酸小檗碱处理大鼠主动脉内皮细胞24 h后，Western Blot检测结果可见25 umol/L、50 umo]/L、75 umol/L、100 umol/L浓度小檗碱促进促凋亡蛋白BAX水平的表达，但是未见浓度依赖性。内皮细胞的凋亡主要与肿瘤坏死因子死亡通路及线粒体途径通路有关。肿瘤坏死因子死亡通路主要包括天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶8（caspase8）和丝裂原激活蛋白激酶（P38MAPK）信号途径。肿瘤坏死因子有调节血管形成的作用.低剂量肿瘤坏死因子能促进内皮细胞形成血管结构：高剂量肿瘤坏死因子能诱导内皮细胞凋亡。BAX基因是BCL-2家族中最重要的一个促凋亡因子，通过BH3区域识别BCL-2蛋白并形成BAX-BCL-2异二聚体，发挥促凋亡作用。。游离BAX可直接在线粒体膜上形成BAX-BAX同二聚体，改变线粒体膜通透性.使细胞色素C释放到胞质，激活下游的caspase3协同细胞凋亡。

本实验发现不同浓度的盐酸小檗碱作用于大鼠主动脉内皮细胞，能抑制其增殖活性及上调促凋亡蛋白BAX的表达，高剂量小檗碱较低剂量小檗碱抑制增殖作用更明显。