四环素耐药基因在养猪场猪粪和土壤中的分布研究

任雪丽+严剑芳+王晓慧+张明+徐佳丽+江涛

摘 要：该文采用PCR方法研究了养猪场中猪粪和土壤中耐四环素乳糖发酵型肠杆菌（TR-LFE）中的tet-R分布和多样性。结果表明，在分离的258株耐四环素乳糖发酵型肠杆菌中，共检测到191株含有tet-R基因，占74.03%。各样品的耐四环素乳糖发酵型肠杆菌中tet-R基因的检出率范围为3.12%～96.87%。根据检出频率的大小，各类tet-R基因的排列顺序为：tet（A），tet（B），tet（M），tet（G），tet（C），tet（D），tet（S），所有样品都没有检测到tet（O）和tet（X）。

关键词：耐四环素乳糖发酵型肠杆菌；四环素耐药基因；猪粪；土壤

中图分类号 S815 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2016）07-13-03

Abstract：In this paper，PCR was applied to analyze the distribution and diversity of tetracycline resistant genes（tet-R gene）in tetracycline resistant Lactose-fermenting Enterobacteriaceae（TR-LFE） separated from swine manure and soil in hoggery.The research results showed that 191 of the 258 strains of TR-LFEs were detected to be tet-R gene positive，accounting for 74.03%.The rates of tet-R gene positive TR-LFE were in the range of 3.12%～96.87%.Based on the detection frequency of tet-R genes，the general rank of tet-R genes was set out as follows： tet （A），tet （B），tet （M） and tet （G） and tet （C） and tet （D） and tet （S）.All the samples were not detected to be tet （O） and tet （X）.

Key words：Tetracycline resistant Lactose-fermenting Enterobacteriaceaer；Tetracycline resistant genes livestock feces；Pig manure；Soil

1 前言

自Pruden等[1]第一次将抗性基因作为一种新兴的环境污染物提出以来，抗性基因在全球范围内引起了广泛的关注。随着人类对抗生素的需求日益增加，抗性基因的污染问题日益加重。抗生素是人类抵御细菌感染类疾病的武器，一旦致病菌获得这些耐药基因，就会形成“超级细菌”，它几乎可以抵御所有的抗生素。如2011年德国暴发了蔓延了欧洲9个国家的“毒黄瓜”事件，是由一种新型的高传染性有毒菌株-O104：H4血清型肠杆菌出血性大肠杆菌引起的，该菌株携带氨基糖苷类、大内环酯类、磺胺类等抗生素耐药基因，因抗生素治疗无效，而导致33人确认死亡，3 000多人受到感染，至少470人出现肾功能衰竭并发症[2]。

目前已发现的四环素类抗性基因的种类达到40种以上，此外还有4种磺胺类抗性基因和10种β-内酰胺类抗性基因。抗生素被用来预防和治疗动物疾病以及用作动物促生长剂，四环素作为一种广谱抗生素广泛用于禽畜养殖业[3]。抗生素进入人或动物体内，会诱导产生抗性菌株[4]，其中25%～75%的抗生素以原态或络合态的形式排出体外[5]，这些抗生素随粪便进入到环境中，会对环境中的微生物产生选择压力，诱导其产生大量的抗生素抗性基因[6]。本文通过普通PCR方法研究了养猪场猪粪和土壤中耐四环素乳糖发酵型肠杆菌（TR-LFE）中的tet-R分布和多样性。

2 材料与方法

2.1 样品采集 本次实验的样品采自上海市松江区某养猪场的新鲜公猪猪粪（GZ）、母猪猪粪（MZ）和养猪场内的蔬菜种植地的土壤（TR）。采样时间为分别为2014年9月、11月和2015年1月。

2.2 菌株分离 乳糖发酵型肠杆菌（LFE）采用麦康凯培养基分离培养，耐四环素乳糖发酵型肠杆菌（TR-LFE）参见文献[7]。

2.3 PCR实验 实验分离出258株耐四环素LFE。采用水煮法提取全细胞DNA，方法参见文献[7]。本实验采用9种不同的目标引物进行普通PCR检测，检测的目的基因为：tet（A）、tet（B）、tet（C）、tet（D）、tet（G）、tet（M）、tet（O）、tet（S）和tet（X）。PCR反应体系和方法参见文献[7]。

3 结果与分析

3.1 TR-LFE中（tet-R）基因阳性菌株的数量统计 采用普通PCR技术对选取TR-LFE携带的四环素耐药基因进行了检测，得出其分布情况。研究结果：分别统计了9月67株（GZ：35株；MZ：32株）；11月96株（GZ：32株；MZ：32株；TR：32株）；1月95株（GZ：31株；MZ：32株；TR：32株）。在检测的258株TR-LFE中，255株为tet-R基因阳性菌，即至少携带1种或2种tet-R基因，占据检测菌株总数的74.03%。从图1可以看出，GZ和MZ分离出的菌株含tet-R基因的菌株所占的比例明显多于其他样品中的比例，范围在78.12%～96.87%。Andrew Bryan等[8]在分离325株高耐药性（耐95μg/mL四环素）的大肠杆菌中检测发现，97%的菌株至少带一种tet-R基因。他们检测的tet-R基因有14种，分别是：tet（A），tet（B），tet（C），tet（D），tet（E），tet（G），tet（K），tet（L），tet（M），tet（O），tet（S），tetA（P），tet（Q）和tet（X）。TR中含tet-R基因的菌株在11月份和1月份的比例分别是25.00%和46.88%，与猪粪样品相比，其比例降低了近50%。

由表3得出，1月份的5个样品中的TR-LFE中出现的tet-R基因检出的情况与前2个月份差异较大。不管是检出频率还是检出的基因数都显著下降。检出基因只有：tet（A）、tet（B）、tet（G）、tet（M）。与9月份的情况相同的是，tet（A）和tet（B）在GZ中有较高的检出率。

综上所述，猪粪的TR-LFE中检测到的基因种类最多，有tet（A）、tet（B）、tet（C）、tet（D）、tet（M）、tet（S）。TR的TR-LFE中出现过3种基因，都为tet（A）、tet（B）和tet（G）。tet（A）在所有样品的TR-LFE中都有检测到，检测率最高，tet（B）次之。这与Al-Bahry SN[9]和Roberts[10]等的研究结果基本吻合；Tao等 [11]在研究珠江水样中tet-R基因时也发现tet（A）和tet（B）广泛分布于珠江分离的大肠杆菌中，而tet（C）和tet（D）仅在珠江的几个采样点的菌株中有检测到。类似地，本实验tet（C）和tet（D）分别仅出现在11月份的GZ和9月份的MZ的TR-LFE中检测到。tet（G）在11月份和1月份的TR中有检测到，未在猪粪样品中检测到。tet（M）主要在猪粪中检测到，几乎每个季度的猪粪中的TR-LFE都有检测到。而tet（S）则仅出现在9月份和11月份的GZ中。能编码核糖体保护蛋白的tet（O）常常由质粒介导，已在一些链球菌和肠球菌中被发现；tet（X）能编码一种氧化还原酶，能在有氧和NADPH存在的情况下将四环素灭活[9]，而本实验所有样品中都没检测到tet（O）和tet（X）。

4 讨论

从养猪场猪粪和土壤中分离的258株TR-LFE中，共检测到191株含有tet-R基因，占74.03%。各样品的乳糖发酵型肠杆菌中tet-R基因的检出率范围为3.12%～96.87%。根据检出频率的大小，各类tet-R基因的排列顺序为：tet（A），tet（B），tet（M），tet（G），tet（C），tet（D），tet（S）。所有样品的TR-LFE中都未检测到编码核糖体保护蛋白的tet（O）和tet（X）。tet（A）和tet（B）是所有样品中TR-LFE中最主要、检出率最大的基因型。

参考文献

[1]Pruden Amy，Ruoting Pei，Storteboom Heather，et al.Antibiotic Resistance Genes as Emerging Contaminants：Studies in Northern Colorado[J].Environmental Science & Technology，2006.40（23）：7445-7450.

[2]苏建强，黄福义，朱永官.环境抗生素抗性基因研究进展[J].生物多样性，2013（04）：481-487.

[3]Thompson S.A.，Maani E.V.，Lindell A.H.，et al.Novel tetracycline resistance determinant isolated from an environmental strain of Serratia marcescens[J].Applied and environmental microbiology，2007，73（7）：2199-2206.

[4]Jiang Xiaobing，Shi Lei.Distribution of tetracycline and trimethoprim/sulfamethoxazole resistance genes in aerobic bacteria isolated from cooked meat products in Guangzhou，China[J].Food Control，2013，30（1）：30-34.

[5]Luo Yi，Xu Lin，Rysz Michal，et al.Occurrence and Transport of Tetracycline，Sulfonamide，Quinolone，and Macrolide Antibiotics in the Haihe River Basin，China[J].Environmental Science & Technology，2011，45（5）：1827-1833.

[6]Srinivasan Velusamy，Nam Hyang-Mi，Sawant AshishA，et al.Distribution of Tetracycline and Streptomycin Resistance Genes and Class 1 Integrons in Enterobacteriaceae Isolated from Dairy and Nondairy Farm Soils[J].Microbial Ecology，2008，55（2）：184-193.

[7]严剑芳，张明，郭怡雯，等.污水处理厂耐四环素乳糖发酵型肠杆菌及四环素抗性基因的研究[J].安徽农学通报，2015，21（07）：33-46.

[8]Bryan A，Shapir N，Sadowsky MJ.Frequency and Distribution of Tetracycline Resistance Genes in Genetically Diverse，Nonselected，and Nonclinical Escherichia coli Strains Isolated from Diverse Human and Animal Sources[J].Applied and Environmental Microbiology，2004，70（4）：2503-2507.

[9]Sn A-B，Bm A-M，As A-A，et al.Escherichia coli tetracycline efflux determinants in relation to tetracycline residues in chicken[J].Asian Pacific Journal of Tropical Medicine，2013，6（9）：718-722.

[10]Roberts MC.Update on acquired tetracycline resistance genes[J].FEMS Microbiology Letters，2005（2）：195-203.

[11]Tao R，Ying G-G，Su H-C，et al.Detection of antibiotic resistance and tetracycline resistance genes in Enterobacteriaceae isolated from the Pearl rivers in South China[J].Environmental Pollution，2010，158（6）：2101-2109. （责编：张宏民）