对丝腺细胞因子SGF—1具有调控作用的家蚕miRNAs功能研究

王欣+陈晨+范洋洋+谢雨辰+钱平+唐顺明+沈兴家

摘要： 为了研究家蚕miRNAs对丝腺细胞因子SGF-1表达的调控作用，以SGF-1为靶基因，利用生物信息学软件RNAhybrid和RNA22预测对SGF-1具有潜在调控作用的候选家蚕miRNAs，经茎环PCR鉴定后分别构建重组表达载体，在细胞水平研究家蚕miRNAs的功能。结果表明，转染了bmo-miR-305*重组质粒组的luc荧光素酶活性比未转染时极显著下调（P<0.01）；转染了bmo-miR-3327*重组质粒组的luc荧光素酶活性比未转染时极显著下调（P<0.01）；再各自转染了inhibitors后荧光蛋白表达量均上调（P<0.05）。说明SGF-1 3′UTR上存在bmo-miR-305*和bmo-miR-3327*的结合位点，且bmo-miR-305*和bmo-miR-3327*对SGF-1的转录后表达具有一定抑制作用。

关键词： 家蚕；miRNAs；丝腺转录因子；SGF-1；功能鉴定

中图分类号： S881.2；Q78 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2016）03-0053-06

microRNAs（miRNAs）作为重要的基因转录后表达调控因子，参与包括发育、代谢、疾病发生等各种重要的生理过程。目前国内外在家蚕miRNAs上开展了相关研究，进行了家蚕miRNAs的鉴定、表达谱分析以及功能预测。至2014年6月，miRBase数据库（http：//www.mirbase.org/）21版本中已记录223个物种的35 828条成熟体miRNAs，并且其数量还在不断增长，其中，在家蚕中共发现487个miRNAs 前体和563个成熟体miRNAs。

大多数miRNAs主要通过与靶基因mRNA 3′端非翻译区（3′UTR）的互补配对，在mRNA或翻译水平负调控靶基因表达[1，2]。目前研究表明，miRNA 的负调控作用不仅存在于靶mRNA 的3′UTR 区，也可发生在5′UTR区[3]。前人研究认为，所有的miRNAs调控作用都是负调控，但Vasudevan等研究发现miRNA具有激活基因表达的作用[4]。Hussain等也通过试验证明除了常见的下调靶基因转录水平，miRNAs能够上调靶基因的转录水平[5]。Miyoshi等还证实了miRNAs除了能够作用于3′UTR外，还能够结合在靶基因的其他位置[6-7]。

miRNA和转录因子（transcription factors，TFs）一样，都能够在转录水平独立调控靶基因的表达水平，而越来越多的研究证明这两者之间能够通过相互作用更精准地对靶基因进行表达调控。通过计算机分析预测，Enright等指出在众多 miRNAs 的潜在靶基因中，TFs作为靶基因的可能性比一般基因大约高出2倍[8]。Cui等在研究基因调控中miRNAs与TFs的相互关系方面也作出了贡献，认为miRNAs更可能靶向含有大量TFs结合位点的基因，而这些基因通常也具有相对更多的miRNAs结合位点[9]。

SGF-1是丝腺特异性细胞因子[10]，存在于中、后部丝腺。SGF-1除了在丝素重链基因（Fib-H）、丝素轻链（Fib-L）和p25基因的上游有其结合位点外，还能与丝胶Ser1基因上游的SA区域结合[11]，说明SGF-1对家蚕丝蛋白基因的表达调控具有重要的作用，特别是在细胞特异性表达方面。而SGF-1自身的表达也要受到调控，为了验证家蚕miRNAs是否对SGF-1的表达具有调控作用，本研究以SGF-1 3′UTR为序列，利用生物信息学软件预测并获得候选miRNAs，通过体外细胞转染试验进行验证，初步筛选可能调控SGF-1的候选miRNAs，为进一步研究miRNAs的功能提供依据，也为阐明蚕丝蛋白合成及调控机制积累试验数据。

1 材料与方法

1.1 材料及主要试剂

家蚕品种p50，由中国农业科学院蚕业研究所提供；E.coli DH10B菌株、昆虫BmN细胞系、重组表达载体质粒pcDNA3 [ie1-egfp-SV40]和重组表达载体质粒PGL3[A3-luc-SV40]均由中国农业科学院蚕业研究所农业部蚕桑遗传与改良重点开放实验室保存。

pMD18-T、限制性内切酶、T4 DNA Ligase、Ex Taq酶、PrimeScript RT-PCR Kit、RNAiso Plus和DNA maker均购自宝生物工程（大连）有限公司；质粒提取试剂盒购自生工生物工程（上海）有限公司；TC-100购自Applichem公司；Fetal Bovine Serum（Qualified，Australia Origin） 购自Gibco公司；UCallM PerFectTM购自药科美公司；双报告基因荧光素酶检测试剂盒购自Promega公司；miRNA inhibitors由百奥迈科生物技术有限公司合成；其他化学试剂均为分析纯，购自国药集团或生工生物工程（上海）有限公司；所有PCR引物合成与DNA测序由生工生物工程（上海）有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 与SGF-1 3′UTR作用的候选家蚕miRNAs的获得 通过NCBI查找到家蚕SGF-1的mRNA序列，（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_001043864.1），获得全长 3 078 bp 的核苷酸，其中cds全长1 049 bp，protein ID=“NP_001037329.1”，除去polyA signal，获得SGF-1基因的3′非编码区序列。通过miRBase数据库中获取家蚕已经登录的全部成熟miRNA序列。利用当前应用比较广泛的2个生物信息学预测软件RNAhybrid[12，13]（http：//bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/rnahybrid/）和RNA22[14]（http：//cbcsrv.watson.ibm.com/rna22.html）进行靶位点的预测，并将二者的预测结果结合起来，根据mfe的高低以及在种子区2～8个碱基互补配对的情况，筛选可能与家蚕SGF-1作用的miRNAs。

1.2.2 候选家蚕miRNAs的克隆与鉴定 分别提取家蚕幼虫期5龄3 d的中后部丝腺总RNA。以miRNAs反转录引物（RT Primer）进行反转录合成的cDNA为模板进行PCR。RT Primer的设计[15]：在通用的茎环结构序列后面加上6个miRNA的反向互补序列；PCR引物的设计：正向引物为miRNA序列的前14个碱基，并在该序列前加上4个碱基使Tm值维持在65 ℃左右，反向引物为miRNA通用引物（表1）。反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，65 ℃ 25 s，72 ℃ 30 s，共34个循环；72 ℃ 10 min。设U6为内参基因。PCR产物经4 %琼脂糖凝胶电泳检测。回收片段大小为80 bp左右的条带，连接至pMDl8-T载体，16 ℃连接过夜后转化至E.coli DH10B，重组质粒酶切鉴定正确后进行测序。

1.2.3 重组表达质粒的构建 利用Oligo 6.0设计pri-miR-305*、pri-miR-3327*和SGF-1 3′UTR的引物。引物序列如表2所示，下划线标记部分：caagctt、ggatcc、tctaga、ggccggcc分别为HindⅢ、BamHⅠ、XbaⅠ、FseⅠ限制性酶切位点。重组载体T-pri-miRNAs和pcDNA3 [ie1-egfp-SV40]分别用Hind Ⅲ和BamH Ⅰ进行双酶切，将目的片段回收后连接到线性化的pcDNA3[ie1-egfp-SV40]上，构建重组表达载体pcDNA3[ie1-egfp-miRNA-SV40]。重组载体T-SGF-1-3′UTR和PGL3[A3-luc-SV40]分别用Xba Ⅰ和Fse Ⅰ进行双酶切，将目的片段回收后连接到线性化的PGL3[A3-luc-SV40]上，构建重组表达载体PGL3[A3-luc-SGF-1 3′UTR-SV40]。

1.2.4 BmN细胞的转染 将pcDNA3 [ie1-egfp-SV40]、pGL3 [A3-luc-SGF-1-3′-UTR-SV40]、pcDNA3.0 [ie1-egfp-pri-miRNAs-SV40]、miRNA inhibitors和内参质粒pRL-CMV分成3组分别进行体外转染试验。第1组包含pGL3 [A3-luc-SGF-1-3′-UTR-SV40]、pcDNA3.0 [ie1-egfp-SV40]和pRL-CMV3种质粒；第2组包含pGL3 [A3-luc-SGF-1-3′-UTR-SV40]、pcDNA3.0 [ie1-egfp-pri-miRNAs-SV40和pRL-CMV3种质粒；第3组包含pGL3[A3-luc-SGF-1-3′-UTR-SV40]、pcDNA3.0 [ie1-egfp-pri-miRNAs-SV40]、miRNAs inhibitor和pRL-CMV4种质粒。每组的质粒浓度稀释至200 ng/μL并按1 ∶ 1的比例混合。

转染方法按照文献[16-17]描述的方法进行：将2 μL/3 μL的上述质粒混合物和5 μL的Cellfectin reagent分别加入到 50 μL unsupplemented（不含胎牛血清和抗生素）TC-100培养基中；将二者轻轻混匀，室温下孵育20 min；吸去12孔细胞培养板中带血清的完全培养基（细胞密度为每个35 mm的细胞培养盘中细胞数达1.0×106～ 1.5×106个），并用unsupplemented TC-100培养基清洗细胞2次；将温育后的混合物加入到清洗后的BmN细胞中，于27 ℃恒温箱中转染 5 h；除去转染液，加入完全培养基于27 ℃恒温箱中继续培养，48 h 后进行荧光素酶活性检测。

1.2.5 荧光素酶活性检测 荧光素酶活性的检测按照Promega试剂盒双荧光素酶报告基因分析系统操作手册进行：转染48 h后，吸去细胞培养孔中的培养液；每孔中加入250 μL 1× Passive Lysis buffer（1 × PLB），使细胞充分裂解；将细胞裂解液转到1.5 mL离心管中，12 000 r/min离心30 s，吸取上清至新的1.5 mL离心管中；取4 μL细胞裂解液加入含有20 μL Luciferase Assay Reagent Ⅱ（LAR Ⅱ）的检测管中混匀，检测管放入Promega荧光素酶检测仪（20/20 n Luminometer，Turner BioSystems）中，开始检测萤火虫荧光；加入20 μL Stop&GloTM，检测海参荧光，记录数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 候选家蚕miRNAs的序列获得及特征分析

SGF-1基因的3′UTR序列由1 986个碱基组成，为了筛选获得与其3′UTR序列匹配的miRNAs，首先在miRBase数据库下载已收录的所有家蚕miRNAs，然后利用靶基因在线预测软件RNAhybrid和RNA22，与SGF-1基因的3′UTR序列进行比对分析，发现20个miRNAs与SGF-1基因3′UTR序列匹配度较高；种子序列区的匹配碱基个数为5、6、7 nt的miRNAs个数分别为3、6、11个（表3）。利用比较基因组学的方法，在miRNAs二级结构的基础上对这20个候选miRNAs进行一系列的特征分析。特殊位置核苷酸偏好程度上可以看出11个55% miRNAs成熟体的5′端首位为尿嘧啶核苷酸 （U），表明该核苷酸在成熟体miRNAs的产生和调控过程中具有重要的意义。这20个候选miRNAs前体的长度变化范围为73 ～ 148 nt，平均（102.9 ± 21.0） nt。统计数据还可看出12个miRNAs位于前体miRNAs的5′端，其余8个位于3′端（表3）。利用Altuvia等的方法[18]对20个候选miRNAs的位置进行分析，并在家蚕基因组数据库中找到4个miRNA簇，分别是：bmo-mir-1a/bmo-mir-1b；bmo-mir-305/bmo-mir-305*/bmo-mir-275；bmo-mir-2731-1/bmo-mir-2731-2；bmo-mir-3362/bmo-mir-3363。

2.2 候选家蚕miRNAs的克隆与鉴定

提取家蚕幼虫期5龄3 d丝腺的总RNA，分别以成熟体miRNAs的茎环引物进行反转录PCR，目的条带在60～80 bp，经凝胶电泳结果显示，共有17个成熟体miRNAs的条带大小符合。将目的片段回收后测序，比对结果显示仅有bmo-miR-1a、bmo-miR-305*、bmo-miR-2731-1/-2、bmo-miR-2775a和bmo-miR-3327*的序列与数据库中提供的数据相符（图1），表明这6个miRNAs在家蚕幼虫期5龄3 d表达。

2.3 候选miRNAs重组表达质粒的构建

分别构建包含候选miRNAs前体序列bmo-pri-miR-1a、bmo-pri-miR-305*、bmo-pri-miR-2731-1、bmo-pri-miR-2731-2、bmo-pri-miR-2775a和bmo-pri-miR-3327*的重组表达质粒，转染BmN细胞并检测绿色荧光。将重组质粒pGL3 [A3-luc-SGF-1-3′-UTR-SV40]、重组质粒pcDNA3.0 [ie1-egfp-pri-miRNAs-SV40]、miRNA inhibitors和内参质粒pRL-CMV分别共转染家蚕BmN细胞，每组进行3次重复。转染48 h后进行荧光检测，结果显示转染后的BmNf细胞均能检测到绿色荧光（图2）。

2.4 bmo-miR-305*和bmo-miR-3327*对SGF-1基因表达的调控作用

转染48 h后进行荧光素酶活性测定，利用萤火虫荧光强度值/海参荧光强度值（Luc/Rlu）对数据进行标准化校正。

结果显示，转染了bmo-miR-305*重组质粒组的luc荧光素酶活性与未转染时比较出现了明显下调（图3-A），且2组之间差异极显著（P<0.01），即转染了bmo-miR-305*表达载体的这组细胞中，靶基因重组质粒的luc荧光蛋白表达量降低了76.04%。利用人工合成bmo-miR-305* inhibitor进一步检验miRNA功能，发现SGF-1 3′-UTR重组质粒荧光蛋白表达量上调（P<0.05）。由此可见，SGF-1 3′-UTR上存在bmo-miR-305*的结合位点，且bmo-miR-305*对SGF-1的转录后表达具有一定的抑制作用。

转染了bmo-miR-3327*重组质粒组的luc荧光素酶活性与未转染时比较出现了明显下调（图3-B），且两组之间差异极显著（P<0.01），即转染了bmo-miR-3327*表达载体的这组细胞中，靶基因重组质粒的luc荧光蛋白表达量降低了79.17%，并在转染inhibitor后升高（P<0.05）。可以推测，bmo-miR-3327*对SGF-1的转录后表达具有抑制功能。

3 讨论与结论

应用生物信息学预测软件来预测家蚕miRNAs是常用的候选miRNAs获得方法。RNAhybrid是Rehmsmeier等和Kruger等基于miRNA和靶基因二聚体二级结构开发的miRNA靶基因预测软件[12-13]，属于第一代靶基因预测软件，RNAhybrid无需考虑靶基因的物种保守性，预测出的miRNAs的数目不多，这是本研究选用该方法的原因之一。RNA22是Miranda等开发的miRNA靶基因预测软件[14]，是第二代靶基因预测软件。结合上述2款预测软件对可能作用于靶基因SGF-1的miRNAs进行分析，共得到20个候选miRNAs。

特殊位置核苷酸偏好程度上可以看出20个候选miRNAs成熟体中，一半以上数量的miRNAs 5′端第1位为U，这与Cao等对miRNAs特征分析的结果[19]一致，在其试验中，成熟体miRNAs 5′端第1位为U的概率为70.73%。可能也说明了在成熟体miRNAs的产生和调控过程中尿嘧啶核苷酸具有重要的意义。

Liu等在Solexa sequencing测序后发现bmo-miR-275/bmo-miR-305/bmo-miR-305*是成簇存在的，但不同组织中的表达不同[20]。He等检测已识别家蚕基因组中miRNAs的位置，同样发现了长度为208 bp 的该miRNAs簇，且在果蝇（Drosophila melanogaster）、拟暗果蝇（D.pseudoobscura）和冈比亚蚊（Anopheles gambiae）中也有发现[21]。bmo-miR-275和bmo-miR-305属于不同的miRNAs家族（mir-275家族和mir-305家族），而这2个miRNAs家族的功能未知。

近年来，越来越多的科研人员选择双报告基因检测系统研究miRNAs的功能。黄勇利用该检测系统将Fib-L 3′UTR重组质粒和miRNAs表达质粒共转染Sf细胞系，发现pA3-miRNA-965、pA3-miRNA-1926能够下调靶基因Fib-L的表达[22]。Chen等利用luc表达系统验证了bmo-miR-1a-3p可能具有很强的抑制作用，且通过结合3′UTR下调BmVMP23[23]。宋菲等初步验证了bmo-miR-2739对Fib-H具有正调控作用[24]。同样，尹纪云、孙锋、刘立会、Jiang等也各自利用该检测系统体外验证了家蚕miRNAs的功能[25-28]。在前人研究的基础之上，笔者构建了pcDNA3 [ie1-egfp-pri-mir-305-SV40]和pcDNA3 [ie1-egfp-pri-mir-3327-SV40]重组载体，并与pGL3[A3-luc-SGF-1-3′-UTR-SV40]共转染BmN细胞系，验证了重组质粒的转染效率和luc荧光蛋白表达活性，并发现miRNAs重组质粒极显著地抑制了luc表达（P<0.01）。该方法简单易行，但也不能够完全模拟体内或细胞内环境下特异miRNAs与靶基因之间的相互作用，因此还需在个体水平进一步研究候选miRNAs对丝腺细胞因子基因SGF-1表达的调控作用。

本研究中，对靶基因SGF-1 3′UTR进行了生物信息学分析，因为动物中常见的miRNAs作用机制是与靶基因mRNA的3′UTR结合后抑制其翻译，但并不对其进行剪切或降解。随着miRNAs研究的丰富，研究人员不但发现了一些新型miRNAs的正调控作用和去抑制作用[29-30]，还发现有些miRNAs能结合靶基因5′UTR，且能够促进靶基因的表达或翻译[31]，而这也为今后在更加广阔的领域中研究家蚕miRNAs功能打下基础。家蚕miRNAs功能研究中，靶基因5′UTR结合位点以及功能的研究尚未有报道，这对于丝腺细胞因子调控机制的深入研究也有一定的启发。或许在不久的将来，我们还会发现更多关于miRNAs和丝腺细胞因子之间的网络调控机制，也为探讨家蚕miRNAs、丝腺细胞因子和蚕丝蛋白基因间的调控机理提供新的试验数据。

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