PI3K/Akt信号通路在胞内布鲁氏菌存活中的作用

张俊波+印双红+李默+冉辉+罗静+李建新+陆安法+郭飞+陈创夫

摘要： 为了检测对PI3K/Akt信号通路在巨噬细胞内布鲁氏菌存活的影响，将布鲁氏菌粗糙型菌株RB51和光滑型菌株S2308分别侵染细胞，应用Western blot技术检测RB51和S2308和对巨噬细胞内p-Akt（S473）和p-Akt（T308）表达的影响；用MTT法检测抑制剂LY294002（LY）对细胞活性的影响；通过菌落计算法，检测抑制剂LY对胞内菌RB51和S2308存活的影响。结果表明，粗糙型菌株RB51和光滑型菌株S2308都可激活 PI3K/Akt信号通路，但粗糙型菌株RB51的激活程度显著弱于光滑型菌株S2308（P<0.01）；抑制剂LY在小于或等于20 μmol/L浓度时不影响细胞活性；抑制剂LY（20 μmol/L）可显著抑制光滑型菌株S2308的存活，但不影响粗糙型菌株RB51的存活。本研究表明，PI3K/Akt信号通路在光滑型菌株存活中发挥重要作用。

关键词： PI3K/Akt信号通路；布鲁氏菌RB51和S2308；胞内存活

中图分类号： S855.99 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2016）03-0036-04

布鲁氏菌病是一种严重危害人类和家畜健康的人兽共患传染病[1-2]。布鲁氏菌为革兰氏阴性的兼性胞内寄生菌，其急性期的临床特点主要为恶寒、发热、关节和肌肉痛等；人感染布鲁氏菌后造成骨关节、神经系统、生殖系统和免疫系统等损害，慢性期主要症状为骨关节病及包括神经系统在内的多系统多器官的损害，患者一般会表现出神经-精神症状，病程较长，容易复发并再感染，从而导致劳动力的丧失。动物布鲁氏菌病的特点是生殖器官、胎膜及其他多种器官组织发炎、坏死和肉芽肿的形成，引起流产、睾丸炎及关节炎等症状。布鲁氏菌病给人类健康和畜牧业和谐发展带来严重危害[3]。因此，研究布鲁氏菌及其对宿主细胞的致病机制，为布鲁氏菌疫苗研发和防控提供理论依据，对于国民经济的发展和社会的安全具有重大的意义。

PI3K/Akt信号转导通路是重要的细胞生存通路之一，Akt作为PI3K/Akt信号转导通路的关键分子，在促进细胞生存、生长、增殖，促进细胞运动、侵袭和转移，抑制细胞凋亡方面起核心作用[4]。PI3K/Akt信号通路与肿瘤的发生发展密切相关，在多种肿瘤组织有Akt的过度表达和活化。PI3K/Akt 信号通路还与一些病毒的生存繁殖密切相关，然而，PI3K/Akt信号通路与布鲁氏菌的生存关系如何，目前尚无相关报道，本研究推测PI3K/Akt信号通路在布鲁氏菌致病过程中发挥重要作用，因此，研究PI3K/Akt信号通路在布鲁氏菌致病过程中的作用，有助于揭示布鲁氏菌的致病机制，为抗布鲁氏菌药物的研制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、细胞与质粒 牛种布鲁氏菌参考株2308和牛种布鲁氏菌疫苗株RB51，由石河子大学人畜共患病实验室提供；大肠杆菌DH5α，由铜仁学院生物与农林工程学院细胞生物学实验室保存。

1.1.2 主要试剂 无内毒素质粒大提试剂盒、增强型 HRP-DAB 试剂盒，购自天根生化（北京）科技有限公司；胎牛血清购自GIBCO公司；细胞转染试剂LipofectamineTM2000，购自Invitrogen公司；酵母提取物（Yeast Extract）、蛋白胨（Tryptone）、NaCl，购自Oxoid公司；琼脂糖购自上海生物工程技术有限公司。MTT、DMSO，且以DMSO作为溶剂，购自索莱宝公司；LY 购自碧云天公司；兔抗鼠磷酸化Akt（Ser473）和Akt（Thr308）、Akt单克隆抗体和HRP—羊抗兔二抗，购自Cell Signaling Technology公司；β-actin购自bioworld公司；ECL荧光检测试剂盒购自Thermo公司；BCA 蛋白定量试剂盒购自上海生物工程技术有限公司。

1.2.3 布鲁氏菌侵染小鼠巨噬细胞RAW264.7 将16M用PBS洗脱菌体，利用细菌比浊法计算数量，按比例通过10倍稀释菌悬液，然后将悬液涂于固体培养基上，置于37 ℃、10% CO2培养箱中培养3 d，每个稀释浓度重复3次，进行计数取平均值确定布鲁氏菌数目。以50 ∶ 1（细菌个数 ∶ 细胞个数）的比例，用16M侵染RAW264.7细胞，并将侵染后的RAW264.7细胞置于37 ℃ 5% CO2培养箱中继续培养。

1.2.4 细胞蛋白质提取 细胞计数并收集1×106个细胞，1 500 r/min 离心5 min弃上清收集细胞。加入1×PBS洗涤3次弃上清。细胞沉淀中加入100 μL RIPA裂解液。加入PMSF （100 mmol/L）10 μL/mL、 Na3VO4（200 mmol/L）5 μL/mL、NaF（0.5 mmol/L） 2 μL/mL、phosSTOP phosphatase inhibitor （Roche） 150 μL/mL，细胞悬浮混匀，在冰上静置 20 min。 4 ℃ 15 000 r/min离心15 min。移出上清置于1支新离心管即为含总蛋白的溶液。

1.2.5 BCA法蛋白浓度测定 吸取50 μL样品于标记好的试管中。加入1 mL BCA工作液，轻柔涡旋混匀。标准检测：37 ℃孵育30 min或室温放置2～16 h。加强型检测：在60 ℃孵育15 min，将试管冷却至室温。在1个干净的吸光杯中加入1 mL水，在波长562 nm调零。将待测液加入干净的吸光杯。10 min内测定并记录所有反应液的吸光度（D562 nm），校正的吸光度为各标样和试样的读数减去空白样吸光度。结合已知的BSA标样的量和校正过的吸光度画出标准曲线。参照标准曲线，根据各蛋白试样的校正吸光度，在标准曲线的线性范围内读出各样品的蛋白浓度。根据样品体积和稀释度计算原来样品中的蛋白量。

1.2.6 Western blot检测 当SDS-PAGE结束时，将含有目的蛋白的凝胶切下，尽量避免用手碰触。同时裁剪6～7张大小和凝胶相同的滤纸和1 张硝酸纤维素膜（NC膜），切除凝胶、NC膜与滤纸 1 角作为标记。将凝胶与NC膜在膜转移缓冲液中静置平衡10 min，NC膜与滤纸分开浸泡。 转膜：将3 层滤纸放于半干式电转仪中，后放胶，将NC膜放于其上，再铺3层滤纸，200 mA 20 V 电泳1～2 h。封闭：小心取出NC膜，放在1 个干净平皿中，用TBST洗膜3次，每次5 min。将NC膜放入杂交瓶中，加入10 mL膜封闭液，37 ℃于杂交仪上封闭1 h。与一抗的结合：倒去封闭液，将NC膜放入盛有TBST的平皿中冲膜3次，每次5 min。将NC膜放入杂交瓶中，加入用TBST稀释的一抗（1 ∶ 1 000），37 ℃于杂交仪上杂交1～2 h。与二抗的结合：用TBST冲膜3次，每次5 min。加入用TBST稀释的过氧化物酶标记的山羊抗兔HRP-IgG二抗5 mL（1 ∶ 3 000），37 ℃于杂交仪上杂交1 h。用TBST冲膜3次，每次10 min。加ECL底物显色液，避光显色1 min，照相。

1.2.7 LY抑制试验 取对数期生长细胞，在10% FBS培养基中2 mL细胞以1×106个/mL密度接种于6 孔培养板中。继续培养6 h后，加入LY，浓度分别选取10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L，1 h后观察p-Akt（S473）和p-Akt（T308）抑制状态。将细胞混悬液立即置入液氮以终止反应，然后以冰冻PBS洗涤细胞3次。细胞收集后，采用1×106个/50 μL RIPA提取总蛋白质，BCA法测定总蛋白浓度。

1.2.8 MTT试验 将抑制剂不同浓度的LY（10、20、40 μmol/L）与巨噬细胞共同孵育，以0.1% DMSO处理细胞为对照。置37 ℃ 5% CO2培养箱，使细胞贴壁培养6～24 h。加入适当浓度的受试化合物，继续培养适当时间。小心吸取上清，加入90 L新鲜培养液，再加入10 μL MTT溶液，继续培养4 h。弃去上清，每孔加入110 L Formazan溶解液，置摇床上低速振荡10 min，使结晶充分溶解，在酶联免疫检测仪490 nm 处测量各孔的吸光度。同时设置调零孔（培养基、MTT、Formazan溶解液）、对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、Formazan溶解液），每组设定3复孔。

1.2.9 布鲁氏菌的培养、计数 将保存的冻干布鲁氏菌接种于10%小牛血清肝琼脂培养基，置CO2培养箱37 ℃、10% CO2培养4 d，挑取单菌落，接种于斜面培养基继续培养4 d，加入2 mL生理盐水，用接种环轻轻刮下斜面培养基上的细菌，以10-1～10-15均匀稀释细菌，并取200 μL 10-13、10-14、10-15稀释菌液涂布于120 mmol/L含有10%小牛血清肝琼脂培养基的平板中，每个稀释度涂2个平板，置于10% CO2 37 ℃ 的CO2培养箱 4 d，对细菌进行平板计数。

1.3 统计学分析

使用SPSS 17.0数据统计软件对试验数据进行统计学分析。

2 结果与分析

2.1 布鲁氏菌对PI3K/Akt信号通路的激活

在布鲁氏菌RB51和S2308侵染巨噬细胞中，其细胞内对应的p-Akt（S473）与β-actin的灰度值比值分别为 0.32±0.034和1.12±0.045，而对照组值为0.12±0.035。经统计学分析，在粗糙型RB51感染细胞的p-Akt（S473）灰度比值显著高于对照组（P<0.01），但又显著低于S2308感染的细胞（P<0.01）。p-Akt（T308）与β-actin的灰度值比值p-Akt（S473）比值趋势是一致的（图1）。然后利用抑制剂LY（20 μmol/L）与巨噬细胞作用1 h，然后分别用RB51和S2308侵染巨噬细胞，结果发现，RB51和S2308诱导的 p-Akt（S473/308） 的表达与对照组无显著差异（P>0.05）。结果表明，在巨噬细胞中，粗糙型的RB51激活PI3K/Akt信号通路的程度极显著弱于光滑型的S2308（P<0.01），并且抑制剂LY可阻断布鲁氏菌对PI3K/Akt信号通路的激活。

2.2 抑制剂LY对巨噬细胞活性的影响

抑制剂LY和DMSO分别与巨噬细胞作用48 h，MTT法检测结果：当抑制剂LY的浓度为10 μmol/L和20 μmol/L时不影响细胞的活性，但是在浓度为40 μmol/L时细胞的成活率降至70%。加DMSO后的细胞形态为小圆球形，与正常细胞形态相同，因此对照组加DMSO不影响细胞的活性。加入LY的浓度为10 μmol/L和20 μmol/L时细胞形态也为小圆球形，与正常细胞形态相同，当LY的浓度为40 μmol/L时，细胞变大，形态开始呈不规则形（图2）。结果表明，采用抑制剂LY的浓度20 μmol/L不影响巨噬细胞的活性，可以进行后续试验。

2.3 阻断PI3K/Akt信号通路对胞内布鲁氏菌存活的影响

抑制剂LY与巨噬细胞作用1 h，然后，分别用RB51和S2308侵染巨噬细胞，分别在4、12、24 h检测布鲁氏菌的CFU，结果显示LY处理细胞中RB51的lgCFU与对照组相比无显著差异（P>0.05）（图3）；而对于S2308菌株，LY处理细胞的lgCFU与对照组相比差异显著（P<0.05）（图3）。结果表明，LY抑制了巨噬细胞内S2308的存活，但对RB51的存活无影响。

3 讨论

PI3K/Akt信号通路与很多疾病有关，在细胞内参与调控物质代谢、细胞增殖与存活等生物学行为。PI3K下游靶蛋白Akt具有丝氨酸/苏氨酸残基，可直接被PI3K激活。在PI3K途径中，当上游信号作用于细胞膜表面时，穿膜受体酪氨酸激酶自磷酸化或磷酸化其他底物后，能在细胞膜内表面产生PI3K结合点，PI3K结合后可产生一些磷脂，然后激活Akt，被激活的Akt可介导细胞生长和分化，同时还可提高抗凋亡基因的表达而抑制细胞凋亡，或活化其他信号转导通路来调控细胞的适应性生存。PI3K/Akt异常激活与体内许多癌症发生密切相关[5]。p-Akt是Akt的功能活化状态，Akt只有被激活后才具有生物学功能。p-Akt在大多数肿瘤组织中过度表达。Akt的活化同时需要催化结构域的Th308位点和C端的调节结构域的Ser473位点2个位点的磷酸化，只有2个位点的磷酸化才能使Akt充分活化从而达到最大活化状态。本研究表明，光滑型菌株（S2308）及可激活p-Akt的Thr308和Ser473 2个位点，充分活化的Akt调控细胞的一系列生理活动；而粗糙型菌株（RB51）也可激活p-Akt的Th308和Ser473 2个位点， 但是与光滑型菌株相比对p-Akt的激活程度显著下降。对p-Akt的激活程度可能与光滑型菌株的毒力强和粗糙型菌株的毒力弱有关。其具体机制还有待于进一步探索。

LPS是布鲁氏菌的经典毒力因子，包括类脂A、核心低聚糖和O抗原或O链3个部分。布鲁氏菌LPS的生物学活性与传统的内毒素不同，主要与其特殊的化学结构有关。当布鲁氏菌LPS的O-多聚糖缺失时，布鲁氏菌从光滑型转变为粗糙型，导致细菌的毒力减弱，易于被巨噬细胞杀死[6～7]。已有研究表明，脂多糖O-型多糖抑制细胞的吞噬作用，抑制溶酶体溶解和宿主细胞凋亡[8]。布鲁氏菌与其宿主细胞最开始的接触是始于布鲁氏菌表面和宿主细胞胞质膜的接触，脂多糖缺失的突变株毒力较亲本株减弱，这说明布鲁氏菌LPS在细菌毒力上具有很重要的作用[9]。本研究推测，对 PI3K/Akt 激活的强弱与布鲁氏菌致病性成正相关，光滑型布鲁氏菌致病性强的原因可能与其LPS能激活PI3K/Akt通路程度较强有关，粗糙型布鲁氏菌致病性弱的原因可能与其LPS能激活PI3K/Akt通路程度较弱有关。

LY （PI3 Kinase Inhibitor） 体内是一个高度特异性的抑制剂。它可以特异地抑制 PI3 kinase的活性，但是不抑制其他的脂质和蛋白激酶活性。研究表明LY可以抑制 PI3K-依赖的Akt磷酸化和激酶活性，它通过和ATP竞争PI3K催化结构域的结合位点发挥作用[10]，从而有效抑制其下游蛋白Akt的磷酸化，已被广泛应用于信号传导通路的作用及靶向治疗的研究中。

布鲁氏菌在宿主细胞中的复制和增殖受到各种因素的影响。为了在宿主细胞中复制和增殖，布鲁氏菌通过激活宿主细胞内信号通路控制宿主细胞的存活、凋亡和自噬，以逃避宿主免疫应答。已有研究表明，某些病毒为了更加有效地进行复制，通过激活PI3K/Akt信号通路抑制宿主细胞的早期凋亡、促进细胞自噬和抑制细胞免疫以延长在胞内的复制时间[11-13]，甲型流感病毒的NS1蛋白可与PI3K的p85β亚基结合而激活PI3K/Akt。但是PI3K/Akt是否在布鲁氏菌感染中起作用尚无文献报道。本研究发现，LY抑制PI3K/Akt信号通路后，光滑型布鲁氏菌S2308存活能力显著下降，而粗糙型菌株RB51存活力无显著变化。本研究表明，PI3K/Akt信号通路抑制后主要影响光滑型菌株的生存，其具体机制还有待于进一步探索。

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